香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段、编码蛋白、制备方法及用图
【专利说明】香薛C91-3菌株的因片段、编码蛋白、制备方法及用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的因片段、编码蛋白、制备方法及用途，所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤、清除自由基及染料废水脱色等功能。
【背景技术】
[0002]真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，etal.An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J].B1chem J，2003，374:321-327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等.香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J].中国微生态学杂志，1996，8 (3):38-40] ο体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵，黄敏，宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26 (9) ；656 -658]。虽然目前已有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段、编码蛋白及制备方法的相关报道，但是不同的基因片断的作用效果不尽相同，亟待开发更多的表达蛋白药效强、靶向性好、具备产业价值的香菇C91-3cDNA的基因片段。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的堪因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤、清除自由基及染料废水脱色等功能。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种香燕C91-3菌株的Zaicri/jifl-SS因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0005]—种如权利要求1所述香燕C91-3菌株的ZaicrijOi/7-SS因片段编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0006]—种如权利要求1所述香燕C91-3菌株的ZaicrijOi/7-SS因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行:
a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA;
b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA ；
c.PCR扩增目标基因:
以所得到的cDNA为模板、以具有EcoR I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下:
上游引物EcoR I:
5’-TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG-3’
下游引物Xho I:
5’-GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG-3’ ；
d.回收纯化DNA片段:
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化792bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。
[0007]所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4°C，12000 r/min离心，15 min ;吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混勾后室温静置15 min，再次4°C，12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。
[0008]所述c步骤的PCR反应体系50 μ?: cDNA模板1 μ?，上游引物0.5 μ?，下游引物0.5 μΙ,?ΝΤΡ Mixture 4 μ1、5Χ Prime STAR Buffer 10 μ1、2.5 U/μΙ 的 PrimeSTAR HS DNAPolymerase0.5 Μ.1、灭菌蒸饱水33.5 μ? ;反应条件:98°C变性 10 s，55°C复性 10 s，72°C延伸 1 min，30 个循环；72°C延伸 5 min ;4°C冷却 10 min。
[0009]—种上述香燕C91-3菌株的Zaicri/jifl-SS因片段编码蛋白在制备抗肿瘤、抗氧化或抗衰老药物中的应用。
[0010]一种上述香菇C91-3菌株的因片段编码蛋白在染料废水脱色中的应用。
[0011]本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为
因片段，该基因片段所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤、清除自由基及染料废水脱色等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET_32a原核表达体系中进行高效表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备治疗肿瘤、抗氧化或抗衰老药物，增加药物种类。同时亦可应用于处理纺织工业的染料废水脱色，无二次污染、利于环保。
【附图说明】
[0012]图1是本发明实施例PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0013]图2是本发明实施例所用载体pET_32a (+)双酶切后的电泳图。
[0014]图3是本发明实施例提取的因片段转化后的单克隆阳性菌落。
[0015]图4是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。
[0016]图5是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。
[0017]图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。
[0018]图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白对Hela细胞的生长抑制率。
[0019]图8是本发明实施例纯化后的目标蛋白对Hep-2细胞的生长抑制率。
[0020]图9是本发明实施例纯化后的目标蛋白的清除氧自由基率不意图。
[0021]图10是本发明实施例纯化后的目标蛋白对刚果红染料脱色效果示意图。
[0022]图11是本发明实施例纯化后的目标蛋白对活性艳蓝染料脱色效果示意图。
[0023]香菇C91-3菌株保藏日期:2013年3月15日；
分类命名??香叛 Q Lent inula edodes)；
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏号:CGMCC N0.7354。
【具体实施方式】
[0024]a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA:
取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入lml的Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入然后加入0.2 ml氯仿，温和振荡后，4°C，12000 r/min离心，15 min ;吸取上层水相溶液0.5 ml并转移至另一干净的1.5 ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混勾后室温静置15 min，再次4°C, 12000 r/min离心，10 min,弃上清，然后加入75%乙醇1 ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA ；
紫外分光光度计验证纯度，0D260/280比值在1.8-2.0之间。
[0025]进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。
[0026]b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA ；
使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0027]反应体系:香菇菌丝体总RNA (Ιμδ/μ1) 1 μ1、3’ RACE Adaptor (5 μΜ) 1 μ?、dNTP Mixture (10 mM each) 1 Kl、RNase Free dH20 4.5 μ? ；
反应条件:70°C，10 min立即冰上放置2分钟；
然后加入下列组分:5X M-MLV Buffer 2μ1、RNase Inhibitor (40 U/μΙ) 0.25 μ?、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNA酶)(200 U/μΙ) 0.25 Μ.1，体系总体积达到 10 μ?。
[0028]反应条件:42°C，60 min 70°C，15 min得到反转录反应液(cDNA)。
[0029]c.PCR扩增目标基因:
以所得到的cDNA为模板、以具有EcoR I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下:
上游引物EcoR I:
5’-TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG-3’
下游引物Xho I:
5’-GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG-3’ ；
引物委托宝生物(大连)公司合成。
[0030]PCR反应体系50 μ?: cDNA模板1 μ?，上游引物0.5 μ?，下游引物0.5 μ?，dNTPMixture (各 2.5 mM) 4 μΚ5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ?、PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2.5 υ/μ1)0.5 Μ.1、灭菌蒸饱水 33.5 μ? ;反应条件:98°C变性 10 s，55°C复性10 s，72°C延伸 1 min, 30 个循环；72°C延伸 5 min ;4°C冷却 10 min。
[0031]PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中Μ: DL2, 000 DNA Marker ；1:
目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。
[0032]d.回收纯化DNA片段:
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化792bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段，命名为堪因片段。
[0033]实验:
1.因片段序列测定:
测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3因片段核苷酸序列如SEQ ID
N0.1。Latcripin-9的基因片段序列长为792bp的cDNA，其含有264个密码子可读框(0RF)。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。
[0034]2.因片段的克隆表达
2.1载体构建
2.1.1将质粒pET_32a (+)，使用EcoR I /Xho I进行酶切；
反应体系(37°(:过夜): pET-32a (+) (100 ng/μ?) 10 μ? 10 XK Buffer5 μ?
EcoR I (10 U/μΙ)1 μ?
Xho I (10 U/μΙ)1 μ?
dH20 Up to50 μ?
取5 μι进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，Μ: λ -Hind III digest ；1:pET-32a (+)- EcoR I /Xho I ；2:pET_32a (+)_plasmid