水稻小分子RNA osa-miR530在降低水稻株高方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及小分子RNA(microRNA)osa-miR530 在降低水稻株高方面的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上主要粮食作物之一，水稻产量由多个性状决定，株高是水稻品 种最重要的农艺性状之一，中国水稻单产在经历矮化育种和杂交稻育种两次飞跃后， 单产一直停滞不前。为了打破这一局面，以理想株型为模式的超级稻育种提供了重要 途径，其主要策略就是理想株型和杂种优势相结合（Chenetal.，ActaAgronomica Sinica，2001，27:665-673)。由此可见，株型改良是水稻育种的一条主线，而株高是株型改 良的关键性状。水稻株高相关基因的发掘利用和遗传机理研究一直是水稻育种家和分子生 物学家研究的热点之一。
[0003] 植物激素在水稻株高发育中具有重要调控作用，迄今为止，大多数已克隆株高 基因与赤霉素（Gibberellin，GA)、油菜素内酯（Brassinosteriod，BR)和独脚金内酯 (strigolactone,SL)等激素的代谢或信号转导有关。此外，其他开花相关转录因子、细胞壁 形成基因也会影响植物的株高。
[0004] 拟南芥GAs生物合成途径上的相关基因缺失突变均能够导致植株出现严重矮 化或者半矮化表型（Sakamotoetal·，PlantPhysiol, 2004, 134:1642-1653)。在水 稻中发现的3个GA缺陷型半矮化突变体d35、sdl和dl8分别是由0sK02、0sGA20ox2 和 0sGA3ox2 位点变异引起的（Itohetal.，PlantCell，2002，14:57-70;Sasaki etal. ,Nature, 2002, 416:701-702；Itohetal.,PlantMolBiol,2004,533-547)〇 水稻GA去活性酶EUI的过量表达转基因水稻株高显著降低（Zhuetal.，Plant Cell, 2006, 18:442-456)，eui是一个水稻高杆突变体（Zhuetal·，Plant Cell, 2006, 18:442-456)。对水稻0sGA2ox6被增强表达后表现显性矮杆，内源活性GA显 著降低（Huangetal.，JGenetGenomic, 2010,37:23-36)。此外，水稻中发现的最早 的赤霉素不敏感突变体dl，其植株显著矮化，对外源施加的GA不敏感（Ueguchi-Tanaka etal.，Nature，2005, 437:693-698)。研究表明油菜素内酯也是决定株高的重要 激素。BR缺陷型突变体brdl、d2和dll均表现出矮化表型（Hongetal.，Plant J, 2002, 32:495-508；Hongetal. ,PlantCell, 2003, 15:2900-2910；Tanabeetal.,Plant Cell, 2005, 17:776-790)。水稻DLT基因是水BR信号转导负调控因子GSK2激酶的直接下 游靶标，dlt突变体表现为矮化少分蘖。此外，独角金内酯和生长素也参与调解水稻株高和 分蘖。如独角金内酯信号途径相关的多蘖矮杆突变体dlO、htdl/sd-t、htd2/d88/dl4、d27 等（张云辉等，中国农学通报，2014, 30:1-7)。生长素响应因子OsIAAl过表达转基因植株 表现株高矮化、株型松散等特点（Songetal·，PlantMolBiol, 2009, 70:297-309)〇
[0005] 除了植物激素途径，一些调节水稻株高的基因也已被报道。GHD7基因是一个能同 时控制水稻穗粒数、株高和抽穗期3个性状的主效QTL。野生型GHD7等位基因可使抽穗期 大大延迟，株高和每穗粒数显著增加（Xueetal·，NatGenet, 2008, 40:761-767)。DTH8和GHD8,能够同时调控水稻花期、株高和产量这3种农艺性状。DTH8基因自然突变会导致光 周期敏感性减弱和株高降低（Weietal·，PlantPhysiol, 2010, 153:1747-1758;Yanet al.，MolPlant, 2011，4:319-330)，氨基酸序列分析结果表明，GHD8与DTH8是同一个基因。 BUI1基因编码一个植物特异的ClassIIformin蛋白，调控细胞微丝骨架的装配和动态变 化。BUI1的缺失突变使水稻的节间发育异常，表现为最上节间严重缩短，呈弯曲生长（Yang etal.，PlantCell, 2011，23:661-680)。
[0006]MicroRNA是一类长度约22个核苷酸的内源单链RNA，是植物生长发育过程中的关 键调节因子。研究表明，microRNA与植物的生长发育有着密切的关系，植物体内microRNA 及其靶基因表达的改变可以影响多种遗传性状。因此，对水稻microRNA的功能研究能为 水稻农艺性状改良提供新的理论依据和研究方法。本发明从水稻日本晴中分离克隆到 一个小分子RNAosa_miR530，Liu等已经在水稻中预测了该microRNA的序列（LiuBet al.，2005,PlantPhysiol, 139:296-305)，但目前还没有任何相关功能研究的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明从水稻日本晴中分离克隆到microRNA osa-miR530,该microRNA在水稻 中过量表达后，转基因阳性植株的株高明显低于非转基因植株。因此，在水稻中过量表达 osa-miR530对于降低株高，提高耐倒伏能力具有重要意义，这为水稻高产分子设计育种提 供新的资源和研究方法。
[0008] 本发明申请人以水稻的一个microRNAosa-miR530为研究对象，通过过量表达 小分子RNAosa-miR530,使正常的水稻植株变矮。osa-miR530的成熟序列是20个碱基 (5'-TGCATTTGCACCTGCACCTA-3'；SEQIDN0:1)。本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种 日本晴microRNAosa-miR530的前体序列（SEQIDN0:2)，包含157个碱基，正向连接在植 物表达载体pCAMBIA1390-ubi上，得到植物表达载体pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530 ;再进 行遗传转化至水稻中，提高〇sa-miR530的表达，得到osa-miR530表达增强的转基因水稻植 株。在转基因的T3代植株中发现，营养生长阶段及成熟期阳性转基因水稻植株的株高明显 低于非转基因植株：在营养生长阶段，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的78-83% ;在 成熟期，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的80 %。
[0009] 本发明用于构建过量表达osa-miR530的前体植物表达载体、增强osa-miR530表 达的DNA序列如SEQID N0 :2所示。
[0010] 本发明利用水稻品种日本晴的osa_miR530作为应用microRNA，将该microRNA的 前体序列正向转入水稻中，提高osa-miR530的表达水平，转基因水稻植株表现出株高降 低。
[0011] 本发明的优点在于：
[0012] (1)本发明提供了 一种通过降低株高而提高水稻抗倒伏能力的水稻microRNA osa-miR530的应用。申请人在水稻中过量表达osa-miR530后，转基因阳性植株的株高降 低。
[0013] (2)本发明首次分尚克隆了水稻osa_miR530,并首次在水稻中过量表达了 osa-miR530。为培育高抗倒伏水稻品种提供了新的思路，也有助于进一步研究osa-miR530 和靶基因互作在调控植物株高过程中的作用机制。
[0014] (3)本发明中应用的microRNA可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物抗倒伏研 究提供支持。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明的osa-miR530表达载体的构建示意图。将克隆在pMD18-T载体 上的osa-miR530利用BamHI和Spel酶切，替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI 和Spel之间的DNA片段，这样osa-miR530正向插入玉米泛素基因启动子（Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530 植物表达载体。
[0016] 图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中osa_miR530转录本相对表达水平结果 图。其中osa-miR530_ox表示转osa-miR530 的植株，#a-l、#a-4、#b-l、#b-2 和 #c-l代表 独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-la作为荧光定量PCR分析的内参基 因。
[0017] 图3为转osa_miR530水稻植株和野生型植株在四叶一心期和孕穗期株高比较 图。A图是四叶一心期表型图；B图是孕穗期株高表型；C图是孕穗期株高比较图。其中 osa-miR530-〇x表示转osa-miR530的植株，#a-l、#b-l和#c-l代表独立的阳性转基因株 系；WT代表野生型水稻植株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显著（P〈0. 01)。
[0018] 图4为转osa_miR530水稻植株和野生型植株在成熟期期株高比较图。A图是成 熟期表型图；B图是成熟期株高比较图。其中〇sa-miR530-〇X表示转osa-miR530的植株， #a-l、#b-l和#c-l代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。林表示根据 TTEST统计学分析差异极显著（P〈0. 01)。
[0019] 图5为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期植株不同节间长度比较图。 A图是成熟期植株不同节间长度表型图；B图是第一节间至第五节间的节间长度比较图。其 中osa-miR530_ox表示转osa_miR530的植株，#a_l、#b_l和#c_l代表独立的阳性转基因 株系；WT代表野生型水稻植株。*表示根据TTEST统计学分析差异显著（P〈0. 05) ;**表示 根据TTEST统计学分析差异极显著（P〈0. 01)。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆〇sa_miR530、构建表达载 体以及验证功能的方法。根据以下的描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基 本特征，并且在不偏离本