一种提高植物叶片淀粉含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高植物叶片淀粉含量的方法。
【背景技术】
[0002] 绿色植物通过光合作用固定二氧化碳，生成碳水化合物，这其中的大部分都以淀 粉的形式储存下来。根据其生物合成的时空差异，淀粉可以分为两类：储藏淀粉（reserve starch)和瞬时淀粉（transitorystarch)。储藏淀粉指的是合成和降解均发生在储藏器 官（例如种子、根、块茎等）的淀粉存在形式，它是人类饮食中的重要组成部分，其所提供的 平均热量占据人均每天所需能量的50%。瞬时淀粉又叫叶片淀粉（leafstarch)，指的是 存在于植物叶片当中的、白天在叶肉细胞中合成、夜晚被降解的淀粉存在形式。叶片淀粉降 解代谢所产生的麦芽糖（maltose)和葡萄糖（glucose)在被运出叶绿体后能够为植物夜间 的生命活动提供能量来源（Strebetal.，2012)。作为人类或其他动物主要的食物来源，淀 粉具有非常重要的食品用途。除此之外，淀粉还具有广泛的工业用途，可以应用于造纸、化 妆品制造、制药等行业，还能够作为原材料参与到环保制品如生物降解塑料、环保涂料及生 物燃料乙醇的生产过程中。
[0003] 农业生产过程中，通常收获的作物组织大都是储藏淀粉积累的器官，这其中包括： 小麦、大麦、玉米、水稻、高粱等谷类作物的种子；红薯、萝卜、甜菜等的作物的根；马铃薯、 山药等作物的块茎等。收获后的作物的其余地上部分（如叶、茎等）中仍有大量的生物量 (如淀粉、纤维素等碳水化合物）存在。但在实际农业生产中，这些植物组织除部分被用于 牲畜饲料外，大都被焚烧或废弃在田中，致使组织中的生物量得不到有效的利用。随着科技 的进步，越来越多的淀粉工业用途被人们所认识到（如上所述）。尤其是再生能源乙醇的有 效、成功制备将大大缓解全球石油资源短缺、大气污染严重的现状，具有诱人的发展前景。 未来对作物储藏器官以外的其余地上部分在工业用途上的合理使用，将有效地实现生物量 的综合、循环利用。
[0004] 目前对植物叶片淀粉降解的研究表明，这是一个主要发生在叶绿体中、需要诸 多酶类共同参与的生物过程。根据参与的步骤不同，可以将这些酶类分为两大组：一组 主要负责淀粉颗粒（starchgranule)的可逆磷酸化，另外一组负责淀粉链的水解。第 一组酶类中包括能够磷酸化淀粉粒的两种葡聚糖水合二激酶（glucan,waterdikinase) GWD(glucan,waterdikinase)、PWD(phosphoglucan,waterdikinase)(Ritteet al·，2006)和负责去磷酸化的磷酸酶SEX4(forStarchExcess4)或LSF1(forLikeSex Fourl)(Kottingetal·，2009 ;Comparot_Mossetal·，2010)。第二组酶类主要包括 淀粉酶（β-amylase)BAM1、BAM3 和脱支酶（debranchingenzyme)SA3、LDA(Fultonet al.，2008;Kaplanetal.，2005;Delatteetal.，2006;Wattebledetal.，2005)。β-淀 粉酶能够催化α-1，4-糖苷键（α-1，4-glycosidicbond)的水解，从葡聚糖链的非还原 端（nonreducingend)释放麦芽糖；脱支酶作用于支链淀粉（amylopectin)α-1，6-糖苷键 (a-l，6_glycosidicbond)的水解从而去除糖链分支（Zeemanetal·，2010)。任何上述 淀粉降解相关酶类的功能失常，都可能导致叶片淀粉的降解受阻，并最终在叶片中呈现淀 粉过量积累的表型（starch-excess phenotype)，这就是经典的质体内淀粉降解途径，这一 结论在拟南芥的上述酶类相关突变体中得到了有力的证明（Critchley et al.，2001 ;Chia et al. , 2004 ；Niittyla et al. , 2006；Comparot-Moss et al. , 2010 ；Zeeman et al. , 1998； Niittyla et al·，2004 ;Fulton et al·，2008)。除了经典的质体内淀粉降解途径外，植物 体内还存在另外一条依赖于细胞自噬的淀粉降解途径，该途径中，自噬小泡能够将某些未 知条件下进入胞质的小的淀粉粒类似物（SSGLs)运送到液泡中进行降解，自噬相关关键基 因ATG6等的沉默会导致植物叶片出现不同程度的淀粉积累表型（Wang et al.，2013)。综 上所述，通过干扰叶片淀粉的降解过程可以提高植物绿色组织中的淀粉积累量。这些高淀 粉含量的植物绿色组织的获得将为实现淀粉各种工业用途提供大量的原材料来源。
[0005] 微管是植物细胞骨架的重要组成部分，由微管蛋白a-tubulinsand β-tubulins形成的蛋白二聚体进一步聚合而成的具有极性的管状结构。它参与到植物体 内的多项重要生命过程中，如细胞分裂、极性生长、细胞壁的形成、胁迫信号的感应及内膜 系统的组织和运输等。
[0006] 病毒诱导的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS)是基于植物对RNA 病毒防御机制发展的RNA干扰技术，通过携带目标基因片段的病毒侵染植物，诱导植物内 源基因的沉默、引起表型变化，进而研究目标基因的功能。相比传统的通过转基因实现RNA 干扰的手段，VIGS技术能够省去植物转化的繁琐、费时步骤，在植物当代即可实现基因的有 效沉默和功能分析。其中，TRV介导的VIGS系统已在烟草、番茄等模式研究生物中得到广 泛的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种抑制植物微管聚合的物质的新用途。
[0008] 本发明提供了抑制植物微管聚合的物质在如下（1)-(4)中至少一种中的应用：
[0009] (1)提高植物叶片中的淀粉含量；
[0010] (2)抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径；
[0011] (3)抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径；
[0012] (4)培育高淀粉含量的植物。
[0013] 上述应用中，所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径体现在植物叶片中自噬 结构的减少。
[0014] 上述应用中，所述抑制植物微管聚合的物质为如下1)或2):
[0015] 1)抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质；
[0016] 2)微管解聚剂。
[0017] 上述应用中，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B):
[0018] A)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0019] B)含有所述A)的表达载体；
[0020] 所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体。
[0021]上述应用中，所述表达载体为pTRV2载体；所述重组载体是将序列表中序列1所示 的DNA分子插入pTRV2载体的酶切位点中得到的。
[0022] 上述应用中，所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。
[0023] 本发明的另一个目的是提供一种具有如下1)_5)中至少一种功能的产品：
[0024] 1)提高植物叶片中的淀粉含量；
[0025] 2)抑制植物微管的聚合；
[0026] 3)抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径；
[0027] 4)抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径；
[0028] 5)培育高淀粉含量的植物。
[0029] 本发明提供的具有上述1)_5)中至少一种功能的产品的活性成分为抑制植物微 管聚合的物质。
[0030] 上述产品中，所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径体现在植物叶片中自噬 结构的减少。
[0031] 上述产品中，所述抑制植物微管聚合的物质为如下1)或2):
[0032] 1)抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质；
[0033] 2)微管解聚剂。
[0034] 上述广品中，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B):
[0035] A)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0036]B)含有所述A)的表达载体；
[0037] 所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体。
[0038] 上述产品中，所述表达载体为pTRV2载体；所述重组载体是将序列表中序列1所示 的DNA分子插入pTRV2载体的酶切位点中得到的。
[0039] 上述产品中，所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。
[0040] 本发明的最后一个目的是提供一种培育高淀粉含量的植物的方法。
[0041] 本发明提供的培育高淀粉含量的植物的方法为如下1)或2):
[0042]1)包括如下步骤：将抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质导入植物中，得到高淀 粉含量的植物；
[0043]2)包括如下步骤：在含有微管解聚剂的培养基中培养植物，得到高淀粉含量的植 物。
[0044] 上述方法中，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B):
[0045]A)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0046] B)含有所述A)的表达载体；
[0047] 所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体。
[0048] 上述方法中，所述表达载体为pTRV2载体；所述重组载体是将序列表中序列1所示 的DNA分子插入pTRV2载体的酶切位点中得到的。
[0049] 上述方法中，所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵；
[0050] 所述微管解聚剂在所述培养基中的浓度为10-50μM。
[0051] 上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述植物为烟草，更具体为本 生烟草。
[0052] 本发明利用VIGS技术将烟草中的微管蛋白基因TUB8沉默，通过激光共聚焦显微 观察微管蛋白基因TUB8沉默后的烟草微管网络的变化和夜间细胞自噬的情况，并通过碘 染色法和淀粉定量分析试剂盒定性、定量研究微管对叶片淀粉代谢的影响。试验结果表明：TUB8沉默后的叶片细胞中的微管网络呈现异常分布，夜间参与淀粉降解的细胞自噬降解 途径受到一定程度的抑制，TUB8沉默的叶片呈现严重的淀粉积累表型；本发明还通过长黑 暗处理实验和淀粉合成受阻的背景下对TUB8沉默导致的淀粉积累表型进行了研究，证实 了淀粉的降解途径受阻是造成TUB8沉默叶片淀粉严重积累的原因；进一步地通过对TUB8 沉默叶片及细胞自噬关键基因ATG6沉默叶片中的淀粉积累量的比较显示，TUB8沉默叶片 的淀粉积累表型不仅单单是由淀粉的细胞自噬降解途径被抑