一种fth1基因可控表达的稳定细胞株的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及细胞株的构建。
【背景技术】
[0002] 临床上，磁共振成像（MRI)广泛用于对疾病的诊断、分期、随访及预后判断；在分 子影像学领域，MRI因为空间分辨率高，软组织对比度好以及无辐射损伤等优势具有较大应 用潜力，尤其适用于对移植细胞示踪的研究。MRI主要通过磁标记成像和报告基因成像两 种方式实现对移植细胞的示踪，前者采用MRI对比剂如金属螯合物或者超顺磁性氧化铁颗 粒（SPI0)直接标记细胞。由于SPI0横向弛豫率高，目前在细胞示踪成像上应用广泛。但 是，这种利用MRI对比剂直接标记细胞的方法，存在一个很大的缺陷，即对比剂会随着细胞 的分裂增殖逐渐降解，因而无法对移植细胞进行长期示踪。磁共振报告基因成像借助报告 基因在细胞内持续稳定表达，能够克服上述磁标记成像存在的缺陷，很大程度上可实现对 移植细胞的长期活体示踪。
[0003]目前用于MR显像的报告基因有多种，如β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、转铁蛋白受 体、MagA和铁蛋白基因等。在众多的MRI报告基因中，铁蛋白基因作为一种内源性报告基因 近年来备受关注。铁蛋白为一种储铁蛋白，有重链和轻链两种亚基。其中，铁蛋白重链多肽 1 (FTH1)具有亚铁氧化酶的活性，可以促进铁的氧化和掺入，作为一种功能性磁共振报告基 因已成为分子影像学研究的热点。
[0004] 然而，FTH1作为MRI报告基因的安全性是值得考虑的。目前，对FTH1表达对细胞 有无影响的研究结果不完全一致。一些研究证明FTH1是一种抗凋亡基因，它可以增加细胞 或组织对抗氧化应激的能力。然而，也有报告指出，在某些特定的细胞如宫颈癌Hela细胞、 鼻咽癌细胞中，FTH1的过表达会明显降低细胞的增殖活性。此外，以铁为成像介质的报告 基因长期持续表达还会诱发铁代谢紊乱。虽然铁是新陈代谢中多种生物活性酶的重要辅助 因子，然而，过多的铁会诱发大量活性氧自由基产生，从而导致细胞的损伤或凋亡。
【发明内容】
[0005] 基于上述技术问题，为了尽量减少FTH1持续表达并聚铁带来的不利影响，本发明 对FTH1的表达水平和表达时间进行了精确调控，使其在需要MR成像时表达，不需要MR成 像时关闭。
[0006] 本发明的目的通过以下措施实现的：
[0007] -种FTH1基因可控表达的稳定细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0008] (1)获取FTH1基因；
[0009] (2)将FTH1基因转入Tet-Οη载体获得重组质粒；
[0010] (3)将重组质粒构建为慢病毒载体；
[0011] (4)接种人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH)，待细胞融合达40-50%，加入慢病毒液 0. 8μΙ/ml(滴度为1X109TU/ml)和聚凝胺5μg/ml，聚乙二醇0. 5-1μg/ml的完全培养基， 放入培养箱中培养20-24h;
[0012] (5)细胞传代后，细胞融合50-60 %，加入8μg/ml嘌呤霉素的培养基处理7d，再 加入4μg/ml嘌呤霉素的培养基筛选3d，获得可诱导表达FTH1基因的稳定细胞株，命名为 SK-N-SH/Tet-on/FTHl〇
[0013] 在利用MRI报告基因对移植细胞标记显像的示踪过程中，问题之一是如何让携带 报告基因的慢病毒成功、高效地感染目的细胞。在构建稳定细胞株过程中，由于基因片段的 插入、病毒液以及筛选抗生素对细胞的作用，均会对细胞产生毒副作用，而本发明有效降低 了这些因素对细胞的不利影响。另一方面，本发明使FTH1基因、Tet-Οη控制系统在SK-N-SH 细胞乃至动物体内有效的整合，协同作用，实现精确控制、可控表达，并能在有机体内长期、 稳定的通过MRI检测亦踪。
[0014] 上述FTH1基因可控表达的稳定细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0015] ?目的基因FTH1的获取：设计引物，上下游引物分别带有Age I和FcoR I酶切位 占.
[0016] FTH1-F: 5 ' -AACCGTCAGATCGCACCGGTGCCACCATGACGACCGCGTCCACCTC-3'
[0017]FTH1-R：5, -TCCTTGTAGTCCATGAATTCGCTTTCATTATCACTGTCTC-3'
[0018] PCR扩增，其条件是：94 °C，5min;94 °C，30s;55 °C，30s;72 °C，2min;30cycle; 72°C，10min;4°C保存；
[0019] ?将FTH1基因片段转入Tet-on载体构建重组FTHl/Tet-on载体；将重组FTH1/ Tet-on载体转入DH5α感受态细菌；培养重组细菌，进行质粒抽提，-20°C保存；
[0020] ?重组质粒转染
[0021] 1)将293T细胞接种于培养皿中，密度为6X106/10ml，细胞融合度约50%时可行 质粒转染；
[0022] 2)重组质粒、pHelperL0、pHelper2.0以4 : 3 : 2的比例与相应体积的 Opti-MEM混合均匀，总体积2. 5ml，室温温育5min;
[0023] 3) 100μ1脂质体2000与2. 4mlOpti-MEM培养基混匀，室温温育5min;
[0024] 4)混合DNA稀释液和脂质体2000稀释液；
[0025] 5)将混合液加入293T细胞的培养液中，培养细胞6~8h弃去原培养基，加入新鲜 培养基，注意观察细胞状态；
[0026] ?慢病毒的收集
[0027] 1)收集转染72h的293T细胞上清液，离心（4°C，4000g，10min)，吸取上清，过滤于 离心管内，超速离心（4°C，25〇OOrpm，2min);
[0028] 2)倒掉上清，用预冷的PBS或DMEM重悬病毒，4°C冰箱过夜；
[0029] ?慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞
[0030] 1)将SK-N-SH细胞接种在6孔板中，接种密度为1~2 X 105/孔；
[0031] 2)待细胞融合度达40 %~50 %时，进行慢病毒感染：
[0032] 3)弃掉旧培养基，加入含2μ1病毒液（滴度为1X109TU/ml)和5μg/ml聚凝胺、 0. 5-1μg/ml聚乙二醇的新鲜完全培养基，放入培养箱中继续培养；
[0033] 4) 12h后观察细胞状态，若无明显细胞毒性，继续培养10~12h后更换为无病毒的 新鲜完全培养基；
[0034] ?稳转株筛选
[0035] 1)待6孔板内感染病毒的细胞融合度达85%~90%时，胰酶消化，将细胞传代至 75ml培养瓶内培养；
[0036] 2)当细胞融合度达50 %~60 %时，加入含嘌呤霉素（终浓度为8μg/ml)的完全 培养基筛选7d后，再加入嘌呤霉素浓度为4μg/ml的完全培养基，继续筛选3d，获得稳定表 达抗药基因的可诱导表达FTH1基因的细胞，命名为SK-N-SH/Tet-on/FTHl。
[0037] 有益效果
[0038] 1.本发明采用四环素（Tet-on)诱导基因表达系统，通过将FTH1基因、Tet-on基 因表达系统稳定、高效地转入人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH)中，构建了稳定的细胞株，实 现MRI检测转基因细胞移植物中FTH1诱导表达，为细胞移植示踪提供一种可调控的、安全 的MRI报告基因成像方法。
[0039] 2.利用本发明构建的细胞株成功建立了荷瘤裸鼠模型，且利用此SK-N-SH/ Tet-on/FTHl细胞株容易构建裸鼠肿瘤模型，成功率达99%以上。细胞皮下接种后肿瘤总 体的生长速度较快，主要表现为局限性生长，形态不规则，呈结节状或分叶状，肿瘤组织很 少发生坏死，可浸润邻近大腿肌肉组织，无明显远处转移表现，构建的述肿瘤模型的特点非 常适用于MRI报告基因成像的研究。
【附图说明】
[0040]图 1-1 实施例 1Tet-on可诱导基因表达载体pLenti-Tet-〇n-MCS_3Flag-Puro图 谱
[0041] 图1-2包装质粒pHelper 1. 0图谱
[0042] 图1-3包装质粒pHelper2. 0图谱
[0043]图 2 双酶切pLenti-Tet_on-MCS-3Flag-Puro和FTH1 基因PCR产物电泳结果（Ml: DLlOOOOMarker;A:pLenti-Tet-〇n-MCS-3Flag-Puro载体酶切产物；B:FTH1 基因酶切产 物；M2:DL5000Marker)
[0044] 图3重组细菌克隆PCR产物电泳结果（M:DL5000Marker;1:阴性对照（ddH20); 2:空载自连对照组；3:阳性对照（GAPDH) ;4、6-11:实验组）
[0045] 图4不同浓度Dox诱导72h后FTH1表达变化
[0046] 图5加入0· 6 μ g/ml Dox后FTH1表达的动态变化
[0047] 图6 Dox诱导flag蛋白表达的免疫荧光染色
[0048] 图7 SK-N-SH/Tet-on/FTHl细胞在不同浓度FAC培养72h后T2-WI成像
[0049]图 8SK-N-SH/Tet-on/FTHl细胞MRI彩色编码的R2map
[0050]图 9CCK-8检测SK-N-SH和SK-N-SH/Tet-on/FTHl细胞增殖活性
[0051] 图10普鲁士蓝染色观察SK-N-SH和SK-N-SH/Tet-on/FTHl细胞聚铁能力
[0052] 图11透射电镜观察SK-N-SH和SK-N-SH/Tet-on/FTHl细胞聚铁能力
【具体实施方式】
[0053] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。
[0054] 实施例1
[0055] -种FTH1基因可控表达的稳定细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0056] (1)病毒载体的构建：
[0057] ?目的基因FTH1的获取：根据Genebank中FTH1 (BC000857)信息合成FTH1基因 的cDNA序列，设计引物，上下游引物分别带有AgeI和EcoRI酶切位点；
[0058]FTH1-F：
[0059] 5, -AACCGTCAGATCGCACCGGTGCCACCATGACGACCGCGTCCACCTC-3'
[0060] FTH1-R：
[0061] 5' -TCCTTGTAGTCCATGAATTCGCTTTCATTATCACTGTCTC-3'
[0062] PCR反应体系：
[0063]
[0064] PCR扩增条件：94Γ，5min;94Γ，30s;55Γ，30s;72Γ，2min;30cycle;72Γ， lOmin;4°C保存；
[0065] ?FTH1基因产物酶切：使用AgeI、EcoRI进行双酶切；
[0066] 酶切反应体系：
[0067]
[0068] 37Γ，反应 4h;7(TC灭火lOmin;
[0069] ?酶切产物琼脂糖凝胶电泳
[0070] 1)制备1%琼脂糖凝胶工作液，完全溶解后倒入已插好梳子的水平胶槽中，厚度 小于5mm