类固醇生成因子1sf-1启动子区高甲基化作为宫内发育迟缓的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及类固醇生成因子1SF-1 启动子区高甲基化及其与宫内发育迟缓的相关性，尤其是涉及一种可用于检测与宫内发育 迟缓相关的类固醇生成因子1SF-1启动子区甲基化程度的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 胎儿宫内发育迟缓（Intrauterinegrowthrestriction,IUGR)是一种危害胎儿 生存质量的严重并发症，病因复杂多样。胎盘功能紊乱是引起IUGR的主要原因之一，但是 其发病机制和带来的影响还不清楚，治疗及预后较差。
[0003] 据统计，我国正常妊娠人群中宫内发育迟缓的发病率约为7. 5%，不仅可造成胎儿 窘迫、新生儿室息和围产儿死亡，而且其危害还将延续到出生后，表现为出生后体格、智力 发育落后，成年后代谢综合征的易感性增加，并可遗传至后代，严重影响人口质量。目前，常 用的宫内发育迟缓产前诊断方法有B超检查、脐动脉血流频谱分析和系列生化测点法。其 中，B超检查存在确定时间晚（孕6月后）、超声辐射及热效应等缺点；多普勒脐动脉血流频 谱分析特异性不高；生化检测方法敏感性较低，有些还具有创伤性和易感染性（如羊水检 查）。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是解决上述技术中存在的不足，首先建立孕期摄食限制所致大鼠 IUGR模型，因为孕期摄食限制是研究IUGR的经典模型，该模型采用单一影响因素，更好的 模拟了人类孕期营养不良及子宫胎盘功能障碍的状态，即孕期各种影响因素（营养、疾病、 用药、吸烟等不良生活方式）所致IUGR发生的共同原因，而且成模率较高；然后，从表观遗 传修饰角度，利用重亚硫酸盐全基因组测序（BisulfiteSequencing,BS-seq)检测并比较 IUGR母体和正常母体外周血中差异性全基因组甲基化谱，用生物信息学方法模拟预测候选 基因作用的调控网络，重点分析与胎盘功能、胎儿生长发育相关的重要基因，鉴定出与IUGR 易感性升高有关的候选基因及其甲基化修饰模式；进一步应用CRISPR/Cas9技术对母体候 选基因进行靶向敲除，观察其子代IUGR的发生，以确定该基因在IUGR发生中的作用；最终， 提供了一种类固醇生成因子1SF-1启动子区高甲基化作为宫内发育迟缓的分子标记及其 应用。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种可用于检测与宫内发育迟缓相关的类固醇生成 因子1SF-1启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括一对类固醇生成因子1SF-1启动 子区甲基化特异性扩增引物，其中
[0006] 所述的甲基化特异性上游引物具有如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；
[0007] 5'-ATTTGATTTTTTTAGAATCGGGGTTTTGT-3,,
[0008] 所述的甲基化特异性下游引物具有如SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列；
[0009] 5' -CACCTTATCACCACACACTAAACACAACT-3'。
[0010] -种可用于检测与宫内发育迟缓相关的类固醇生成因子1SF-1启动子区甲基化 程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于宫内发育迟缓的检测或筛查药物。
[0011] 本发明立足于临床常见的出生缺陷一IUGR，从表观基因组学的崭新角度，探寻母 体外周血中反映IUGR易感的表观遗传学标志物，首次公开了可用于检测与宫内发育迟缓 相关的类固醇生成因子1SF-1启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。胎盘合胞体滋养层 细胞SF-1DNA高甲基化，导致其表达降低，调控下游凋亡基因表达，引起胎盘滋养层细胞凋 亡增加，导致IUGR发生。同时，胎盘凋亡细胞释放游离DNA进入母体外周血，可从中检测到 胎盘SF-1DNA甲基化以反映IUGR易感。DNA甲基化修饰模式改变作为标志物的优势：1)灵 敏：DNA甲基化等表观遗传修饰改变的信息远较DNA序列更容易受到环境因素（如营养、缺 血缺氧、环境污污染）的影响。2)早期：DNA的异常甲基化早于基因表达改变，在疾病发生 过程中是一个较早的分子事件。3)特异：DNA甲基化可以稳定存在于各种体液中而不被降 解去除，这些检出片段仍保留来源组织的甲基化状态，从而可用于临床诊断。4)可遗传性和 可逆性：这一点在发育与生殖研究中尤为重要，可为出生缺陷的早期治疗提供指导。因此， 本发明为IUGR孕期筛查诊断提供了新的生物标志物，为IUGR的早期预防和干预提供科学 依据。
【附图说明】
[0012] 图1为孕期摄食限制对母体外周血SF-1启动子甲基化水平的影响图；
[0013] A为SF-1启动子区（-280~+60bp)甲基化图；B为SF-1启动子区CpG富集区域 总甲基化频率；C为SF-1启动子区-232, -161，-13, -9, -6CpG位点甲基化频率。数据采用 卡方检验进行分析。Mean土SD，η= 3只孕鼠，与对照组相比*P〈0. 05。
[0014] 图2为孕期摄食限制对孕14日母鼠、胎鼠体重和IUGR率的影响；
[0015] A为母鼠体重；B为胎鼠体重；C为IUGR率。Mean土SD，n= 4-7只孕鼠，与对照组 相比 *Ρ〈0· 05, #Ρ〈0· 01。
[0016] 图3为胎龄14天的胚胎SF-1的mRNA的表达图；
[0017] 图4为FFlbgRNA靶点及引物序列示意图；
[0018] 图5为Cas9gRNA/mRNA的体外合成产物电泳图；
[0019] 图6为筛选携带Cas9/gRNA靶点的F0,Fl，F2成鱼示意图；
[0020] A为SURVEYOR检测R)胚胎Cas9/gRNA靶点突变活性；B为克隆测序验证R)胚胎 Cas9/gRNA靶点；C为SURVEYOR检测筛选携带Cas9/gRNA靶点突变F1成鱼；D为直接测序 验证携带Cas9/gRNA靶点F1成鱼；E为SURVEYOR检测筛选携带Cas9/gRNA靶点突变F2成 鱼；直接测序验证携带Cas9/gRNA靶点F2成鱼；WT为野生型；MU为突变型；白色箭头为突 变型被酶切为两条带。
[0021] 图7为3月龄野生型（WT)、杂合型（+/-)FFlb相对mRNA水平；
[0022] 每组鱼尾各10例进行合并，重复3次。
[0023]图8为母体FFlb敲低后子代胚胎体长、大体形态学评分（GMS)、体节数、发育迟缓 率变化示意图；
[0024] A为体长；B为GMS;C为体节数；D为发育迟缓率；E，F为6dpf幼鱼整体表型；G，Η 为6dpf幼鱼卵黄及鱼鳔表型。Mean土SD，η= 3,与对照组相比*P〈0. 05。sb:鱼鳔；Y:卵 黄。
[0025] 图9为母体FFlb敲低后12hpf胚胎goosecoid，krox20mRNA水平比较图； Mean土SD，η= 3亲本斑马鱼，与对照组相比*P〈0. 05。
【具体实施方式】
[0026] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0027] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实 验室指南》（NewYork:ColdSpringHarborlaboratoryPress, 2001)中所述的条件进行。
[0028] 【实施例1】鉴定出与IUGR易感性升高有关的差异甲基化候选基因
[0029] 本发明首先建立孕期摄食限制所致大鼠IUGR模型，因为孕期摄食限制是研究 IUGR的经典模型，该模型采用单一影响因素，更好的模拟了人类孕期营养不良及子宫胎盘 功能障碍的状态，即孕期各种影响因素（营养、疾病、用药、吸烟等不良生活方式）所致IUGR 发生的共同原因，而且成模率较高；然后，从表观遗传修饰角度，利用重亚硫酸盐全基因组 测序（BisulfiteSequencing,BS-seq)检测并比较IUGR母体和正常母体外周血中差异性 全基因组甲基化谱，用生物信息学方法模拟预测候选基因作用的调控网络，重点分析与胎 盘功能、胎儿生长发育相关的重要基因，鉴定出与IUGR易感性升高有关的候选基因及其甲 基化修饰模式。
[0030] 1、建立孕期摄食限制所致大鼠IUGR模型
[0031] 成年Wistar大鼠32只，体重200±20g，适应性喂养一周后，每晚18:00按雌 雄2:1比率进行合笼交配，次晨进行雌鼠阴道涂片，在显微镜下检见精子者记为受孕0天 (gestationalday0,⑶0)。确定受孕后将孕鼠随机分为2组：对照组和摄食限制组。自 ⑶0开始，正常组正常摄食，摄食限制组给予正常组50%食物（将己怀孕的