一种沙眼衣原体/解脲脲原体核酸检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种沙眼衣原体/解脲脲原体核酸检测试剂盒，具体涉及一种荧光定 量PCR沙眼衣原体/解脲脲原体核酸检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 沙眼衣原体（CT)是一种具有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生 物，是一类介于病毒、细菌和立克次体之间的特殊微生物，在微生物分类上属于细菌门、立 克次体纲、衣原体目及衣原体属。是国内外最常见的性病病原体之一，在我国生殖道衣原体 感染居STD的第三位，且其发病率有逐年增高的趋势。机体感染CT后，能诱导产生型特异 性细胞免疫和体液免疫，但通常免疫力不强，且维持短暂，因而常造成持续感染、隐性感染 和反复感染。
[0003] 解脲脲原体又称解脲支原体（UU)，属于柔膜纲支原体目支原体科的脲原体属，是 一类介于细菌与病毒之间的最小原核微生物，主要分布于人体泌尿生殖道内，并通过性接 触而传播，也可由母体垂直传染给胎儿。男性生殖道最常见的寄生处在尿道口和精液中，女 性生殖道最常见的寄生处在阴道。解脲脲原体是非淋菌性尿道炎的主要病原体之一，感染 后可导致多种生殖道炎症。在男性，可导致非淋菌性尿道炎、急性附睾炎、前列腺炎等的发 生；在女性可引起包括子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎等，宫内感染可引起流产、死胎、早产 等不良后果。
[0004] 目前沙眼衣原体和解脲脲原体的诊断方法主要有培养法和免疫学方法，其中，培 养法的特异性和敏感性高，但临床检测时间过长（至少需要24h-48h，甚至更长时间），过程 繁琐，需要使用特殊的培养介质以及易受杂菌影响，不适用于大范围检测。免疫学方法简便 快捷，但特异性差、灵敏度不高。近年来，聚核酶链式反应（PCR)法渐渐显现了其在检测上 的优势，标准PCR过程分为三步：DNA变性（90°C-96°C):双链DNA模板在热作用下，氢键 断裂，形成单链DNA;退火（60°C-65°C):系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双 链；延伸（70°C_75°C):在Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，以脱氧核糖核苷三 磷酸（dNTP)为原料，从引物的3'端开始以从5' -3'端的方向延伸，最终合成与模板互 补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
[0005] 运用PCR技术检测主要涉及到两个方面：核酸的提取和核酸的扩增检测。
[0006]目前，国内临床上主要采用煮沸法对沙眼衣原体和解脲脲原体的核酸进行提取： 先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。煮沸法具有诸多 不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高 速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、 富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的 高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。2)检测灵敏度不高，约在lOOOOcopies/ml左右；3) 没有设置阳性内对照（即内标），无法监控假阴性；4) 一般没有预防PCR产物污染的措施。 另外，对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看 得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无 法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。
[0007] 目前，国内临床上检测沙眼衣原体和解脲脲原体DNA的方法主要基于实时荧光定 量PCR技术及其改进。荧光定量PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来 的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者 治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问 题，减少了污染。实时荧光定量PCR技术使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检 测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检 测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动 分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状， 可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软 件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对 比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构 完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有 靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬 灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光 检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结 束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的 定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方 法，得到十分广泛的应用。
[0008] 多重PCR技术是在PCR技术的基础上演变而来的，主要用于多种病原微生物的同 时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时 检测或鉴定，指的是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR 扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定具体病原体的感染类型。多重PCR技术的具有以 下特点：①高效性：在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的 基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。②系统性：多重PCR很适宜于成组病 原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、无芽胞厌氧菌、战伤感染细菌及细菌战剂 的同时检测。③经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时检出，大大的节省时间、试剂 以及其他经费开支，为临床提供更多、更快、更准确的诊断信息。同时，多重PCR技术也可以 结合光谱技术实现荧光定量检测，从而使得测试结果更灵敏、更特异、更精确。
[0009] 但是，多重PCR技术中添加的多种病原微生物的特异性引物设计难度较大，既不 能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，此外，多重PCR中的不同扩增 片段还会互相竞争资源。基于以上原因，多重PCR技术在临床检测中的应用收到了极大限 制。
[0010]目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术检测沙眼衣原体或解脲脲原体DNA的试剂盒应用于临床检测中，但大部分是针对沙眼衣原体或解脲脲原体单一检测方法， 现有技术中很少将多重PCR技术应用于临床检测中。对于临床检测两种以及多种病原体的 要求，必须对同一样本做多管检测才能达到，增加了检测成本和操作繁琐度，降低了检测效 率。并且，这些试剂盒所提供的提取方法主要是煮沸法，特异性差、灵敏度低、检测效果欠 佳。
【发明内容】
[0011] 本发明提供一种沙眼衣原体/解脲脲原体核酸检测试剂盒，以解决现有技术中试 剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。
[0012] 本发明提供一种沙眼衣原体/解脲脲原体核酸检测试剂盒，所述沙眼衣原体/解 脲脲原体核酸检测试剂盒包括：沙眼衣原体/解脲脲原体PCR反应液，所述PCR反应液包括 反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷 酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为：沙眼衣原体探针：5'-CTTAA AAGACAATGGATTACCTAT-3' ；解脲脲原体探针：5' -TGGAAGGGGCAAGAGATGGTAAGT-3'。
[0013] 优选的，所述