甲型h1n1流感病毒核酸的定性检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及诊断技术领域，特别是涉及一种甲型H1N1流感病毒核酸的定性检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 甲型H1N1流感病毒是A型流感病毒，携带有H1N1亚型猪流感病毒毒株，包含有禽 流感、猪流感和人流感三种流感病毒的核糖核酸基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪 流感病毒特征。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早 期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出 现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。2009年开始，甲型H1N1流感在全球范围内大规 模流行。2010年8月，世卫组织宣布甲型H1N1流感大流行期已经结束。
[0003] 在此期间，基于PCR原理的核酸检测方法特别是基于real-timeRT-PCR的方法是 一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。H1N1病毒核酸检测 原理是利用核酸检测的方法，直接检测H1N1病毒的核酸RNA。核酸检测具有快速、高效、敏 感和特异等优点，在感染过程中，患者体内首先出现的是病毒RNA，这时可以采用核酸检测 的方法检测出来。而传统的甲型H1N1流感病毒的核酸定性检测试剂盒通常需要从样本中 提取纯化的核酸分子（H1N1-RNA)，而从样本中提取核酸的步骤操作复杂。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要提供一种不需要从样本中提取核酸就可以完成检测的甲型H1N1 流感病毒核酸的定性检测试剂盒。
[0005] -种甲型H1N1流感病毒核酸的定性检测试剂盒，包括：
[0006] 样本处理剂，包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶 Κ；
[0007] 用于靶核苷酸扩增的上游引物，所述上游引物包括上游引物InfAForword、上游 引物SWInfAForword和上游引物SWHlForword;
[0008] 用于靶核苷酸扩增的下游引物，所述下游引物包括下游引物InfAReverse、下游 引物SWInfAReverse和下游引物SWHIReverse;
[0009] 用于革E核苷酸检测的Taqman探针，所述Taqman探针包括Taqman探针infAProbe、 Taqman探针SWinfAProbe和Taqman探针SWHIProbe，所述Taqman探针infAProbe的 两端分别结合有第一焚光基团和第一焚光猝灭剂，所述Taqman探针SWinfAProbe的两端 分别结合有第二荧光基团和第二荧光猝灭剂，所述Taqman探针SWHIProbe的两端分别结 合有第三荧光基团和第三荧光猝灭剂；以及
[0010] RNA-步法反应缓冲液。
[0011] 在一个实施例中，所述样本处理剂用于与检测样本混合均匀后在55°C~70°C加 热 10min~15min〇
[0012] 在一个实施例中，所述样本处理剂中，所述异硫氰酸胍的浓度为0. 2mol/L~ 2mol/L，所述梓檬酸钠的浓度为10mmol/L~30mmol/L，所述十二烷基肌酸钠的质量百分含 量为0.2%~1%，所述β-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L~0·lmol/L，所述蛋白酶K的浓 度为lmg/mL~5mg/mL〇
[0013] 在一个实施例中，所述上游引物InfAForword的序列为SEQIDNo. 1所示的序 列，所述上游引物SWInfAForword的序列为SEQIDNo. 2所示的序列，所述上游引物SW HlForword的序列为SEQIDNo. 3所示的序列；
[0014] 所述下游引物InfAReverse的序列为SEQIDNo. 4所示的序列，所述下游引物SW InfAReverse的序列为SEQIDNo. 5所示的序列，所述下游引物SWHIReverse的序列为 SEQIDNo. 6所示的序列。
[0015] 在一个实施例中，所述Taqman探针infAProbe的序列为SEQIDNo. 7所示的序 列，所述Taqman探针SWinfAProbe的序列为SEQIDNo. 8所示的序列，所述Taqman探针 SWHIProbe的序列为SEQIDNo. 9所示的序列。
[0016] 在一个实施例中，所述Taqman探针infAProbe的5'端结合有FAM，所述Taqman 探针infAProbe的3'端结合有BHQ1 ;
[0017] 所述Taqman探针SWinfAProbe的 5' 端结合有FAM，所述Taqman探针SWinfA Probe的3'端结合有BHQ1 ;
[0018] 所述Taqman探针SWHIProbe的 5'端结合有FAM，所述Taqman探针SWH1Probe 的3'端结合有BHQ1。
[0019] 在一个实施例中，还包括H1N1内标的RNA转录物、内标上游引物RnasePForward、 内标下游引物RnasePReverse和内标探针RnasePProbe，所述H1N1内标的RNA转录物为 H1N1内标转录得到，所述H1N1内标为非竞争性内标，所述内标探针RnasePProbe的两端分 别结合有第四荧光基团和第四荧光猝灭剂。
[0020] 在一个实施例中，所述内标上游引物RnasePForward的序列为SEQIDNo. 10所 示的序列，所述内标下游引物RnasePReverse的序列为SEQIDNo. 11所示的序列，所述内 标探针RnasePProbe的序列为SEQIDNo. 12所示的序列，所述内标探针RnasePProbe的 5'端结合有HEX，所述内标探针RnasePProbe的3'端结合有BHQ1。
[0021] 在一个实施例中，所述H1N1内标的序列为SEQIDNo. 13所示的序列。
[0022] 在一个实施例中，还包括H1N1阳性质控品和H1N1阴性质控品。
[0023] 这种甲型H1N1流感病毒核酸的定性检测试剂盒在进行检测时，直接将检测样本 与样本处理剂混合处理后即可用于后续检测。相对于传统的甲型H1N1流感病毒核酸的定 性检测试剂盒，这种甲型H1N1流感病毒核酸的定性检测试剂盒省略了从样本中提取纯化 的核酸分子的步骤，从而操作上更为省时、简单。
【附图说明】
[0024] 图1为实施例1优化反应体系和反应条件后线性模板的检测结果图；
[0025] 图2为实施例1线性模板检测的标准曲线；
[0026] 图3为实施例2试剂盒中强阳和临界阳质控品、阴性质控品的检测结果图。
【具体实施方式】
[0027] 下面主要结合附图及具体实施例对甲型H1N1流感病毒核酸的定性检测试剂盒做 进一步的解释说明。
[0028] 一实施方式的甲型H1N1流感病毒核酸的定性检测试剂盒，包括：样本处理剂、用 于靶核苷酸扩增的上游引物、用于靶核苷酸扩增的下游引物、用于靶核苷酸检测的Taqman 探针以及RNA-步法反应缓冲液。
[0029] 样本处理剂包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶 Κ〇
[0030]β-巯基乙醇和异硫氰酸胍协同抑制RNase活性，异硫氰酸胍将RNase变性，暴露 出RNase活性中心的二硫键，β-巯基乙醇打开二硫键，从而抑制其活性。
[0031] 样本处理剂用于与检测样本混合均勾后在55°C~70°C加热lOmin~15min;其 中，样本处理剂与检测样本的体积比可以为2~1 :1。
[0032] 具体的，样本为鼻拭子、咽拭子或分泌物等类型的样本时，须先用生理盐水冲洗后 12000rpm离心5min弃除上清后再与样本处理剂混合。
[0033] 样本处理剂中，异硫氰酸胍的浓度为0. 2mol/L~2mol/L，柠檬酸钠的浓度为 10mmol/L~30mmol/L，十二烷基肌酸钠的质量百分含量为0. 2%~1%，β-巯基乙醇的浓 度为0. 05mol/L~0. lmol/L，蛋白酶Κ的浓度为lmg/mL~5mg/mL。
[0034] 上游引物包括上游引物InfA Forword、上游引物SW InfA Forword和上游引物SW HlForword。
[0035] 下游引物包括下游引物InfA Reverse、下游引物SW InfA Reverse和下游引物SW HlReverse。
[0036] Taqman探针包括Taqman探针inf A Probe、Taqman探针SW inf A Probe和Taqman 探针SW HI Probe。
[0037] 本实施方式中，采用的上游引物、下游引物和Taqman探针均为世界卫生组织 (WHO)在其网站上公布的美国疾病预防控制中心（