用于制备α,ω-烷二醇的方法
【专利说明】用于制备α, ω-烷二醇的方法
[0001]本发明涉及一种用于制备α，ω-烷二醇的方法，所述方法包括下述步骤:a)使烷酸与烷醇反应，产生酯，b)通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯，c)氢化该氧化的酯，形成α, ω-烷二醇和烷醇，和d)蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，和将该烷醇返回到步骤a)中。
[0002]胺和二胺是一类在工业上具有高需求的分子，它们常规地在烃的裂化过程中得至IJ。它们用于例如制备聚酰胺，合成的、商购可得的、热塑性物质。
[0003]胺和二胺的常规化学技术生产依赖于石化原料的供给，低效并且在该过程中形成大量不希望的副产物。由于所述缺点，已经开发了使用生物催化剂从可再生原料出发得到胺的方法。烷烃或烷醇具体地可用作反应物，其可以通过生物技术方法从可再生的原料制备。在现有技术中描述了多种用于将烷烃和烷醇转化成胺的方法，例如，在欧洲专利申请EP11174729.1 和 EP11006458.1 中。
[0004]在现有技术中描述的方法的一个缺点是，用作反应物的烷烃或烷醇的仅部分被转化成产物。相当大部分反应产生不希望的副产物或中间体，或未反应保留在反应混合物中。
[0005]在该背景下，本发明要解决的问题是提供一种用于制备α，ω-烷二醇的方法，在所述方法中，将用作反应物的烷醇以尽可能高的比例引入到期望的产物(优选令人感兴趣的α，ω -烷二醇)中。
[0006]通过本申请的主题和尤其是通过附带的独立权利要求的主题实现了这些和其它目的，其中实施方案由从属权利要求获悉。
[0007]在第一方面中，通过包括下述步骤的方法解决了本发明要解决的问题:
a)使烷酸与烷醇反应，产生酯，
b)通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯，
c)氢化该氧化的酯，形成α,ω-烷二醇和烷醇，
d)蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，和
e)将该烷醇返回到步骤a)中。
[0008]在第一方面的第一个实施方案中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)中的烷酸是式H3c - (CH2)n - C00H的烷酸，且其中η > 0，优选2_16。
[0009]在第一方面的第二个实施方案(其也是第一个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中所述烷酸是丁酸。
[0010]在第一方面的第三个实施方案(其也代表第一个至第二个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)中的烷酸是式CnH2n iCOOH的羧基化的环烷烃，其中η > 4，优选5-8。
[0011]在第一方面的第四个实施方案(其也代表第一个至第三个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中所述烷醇是式Cn0H2n+2的烷醇，且其中η > 0。
[0012]在第一方面的第五个实施方案(其也代表第一个至第四个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)中的烷酸和烷醇具有相同的碳骨架。
[0013]在第一方面的第六个实施方案(其也代表第一个至第五个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)和/或c)中的全细胞催化剂表达烷经轻化酶，所述烧经轻化酶选自??得自恶臭假单胞菌(putida)饱AlkB及其变体和得自 Mcanivoimis borkumensis SK2 的 CYP153 及其变体。
[0014]在第一方面的第七个实施方案(其也代表第一个至第六个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中借助酸催化的酯形成进行步骤a)，优选地在有机溶剂存在下。
[0015]在第一方面的第八个实施方案(其也代表第一个至第七个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中借助与酯酶、蛋白酶或脂肪酶(优选地以表达酯酶或脂肪酶的全细胞催化剂的形式提供)接触，在水溶液中进行步骤a)。
[0016]在第一方面的第九个实施方案(其也代表第一个至第七个实施方案的一个实施方案)中，通过这样的方法解决了所述问题，其中通过将烷烃氧化成烷酸来提供步骤a)中的烷酸。
[0017]根据本发明的方法首先在步骤a)中提供烷酸与烷醇的反应，产生酯。该反应的合适反应条件是本领域技术人员已知的。例如，可以直接在酸催化下进行酯化。在该情况下，优选地由与酸和醇的平衡中蒸馏除去酯。所述烷醇优选地是式Cn0H2n+2的烷醇，其中η大于0，且优选 1-4，最优选 4，且例如是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22。
[0018]优选地在有机溶剂存在下进行步骤a)。特别合适的溶剂是仲醇和叔醇，特别是支化的醇诸如2-甲基-2- 丁醇。另外合适的是醚诸如叔丁基甲基醚或环烷烃诸如己烷和甲基己烷或芳族溶剂诸如甲苯。
[0019]在一个优选的实施方案中，通过与水解酶接触来进行步骤a)，所述水解酶优选地选自酯酶、蛋白酶或脂肪酶。在现有技术中描述了合适的水解酶。特别合适的是，例如，得自 Novozymes 的脂肪酶 Novozym?435。
[0020]在步骤a)之后，在步骤b)中通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“全细胞催化剂”被理解为是指完整的、存活的和有代谢活性的细胞，其提供期望的烷烃羟化酶的酶活性。该全细胞催化剂优选地是原核细胞，优选是细菌细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个优选的实施方案中，它是低等真核细胞，优选是酵母细胞。原核细胞的例子包括埃希氏菌属(fccAericAia)，特别是大肠杆菌{.Escherichia coJi)，和假单胞菌属 iPseuckmonas')和棒杆菌属(Corynebacter 111111)的菌株。低等真核细胞的例子包括酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、子囊菌酵母属(Yarrowia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是菌株热带假丝酵母(Candida tropical is)、粟酒裂殖酵母(Schizosacctmromyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pas tori s')、解脂耶氏酵母(Yarrowia JijOoXriica)和酿酒酵母(合适的全细胞催化剂、通过基因工程方法制备它们的途径和培养操作是本领域技术人员已知的。
[0021]对于步骤b)中的氧化，该全细胞催化剂必须具有烷烃羟化酶。此外有利的是，根据本发明的全细胞催化剂具有有利于烷烃羟化酶的活性的其它酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“烷烃羟化酶”被理解为是指这样的酶:其催化未被取代的包含至少6个、优选12个碳残基的直烷基残基的羟基化。示例性氧化系统尤其描述在PCT/EP2008/067447 中。
[0022]烷烃羟化酶优选地是CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。在一个优选的实施方案中，术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”被理解为是指这样的细胞溶质氧化酶:其是另外含有铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的3-组分体系的一部分，具有烷烃结合位点和将烧经轻基化的能力。在一个特别优选的实施方案中，它是:与得自Mcanivomxborkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)具有至少80%、优选90%、最优选95%或99 %序列同一性的酶，或者是含有一种多肽序列且另外具有烧经轻化酶活性的酶，所述多肽序列与得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)具有至少80%、优选90%、最优选95%或99 %序列同一性。如贯穿本申请的，所述数据库代码在这里是指基于NCBI (国家生物技术信息中心，Bethesda，USA)的数据库，更精确讲，2013年1月11日可在线获得的版本。在一个优选的实施方案中，术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”被理解为是指非膜结合的氧化酶，其包括用于烷烃、未被取代的直烷基残基(包括至少5个、优选12个碳残基)或单羟基化的烷烃的结合位点，且其多肽链含有基序LL (I/L) (V/I) GGNDTTRN。在一个优选的实施方案中，本文中使用的“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”是得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)或其变体，其优选地具有烷烃羟化酶活性。
[0023]为了给CYP153家族的细胞色素Ρ450单加氧酶最佳地供给来自还原剂(优选NADH)的电子，优选的是，所述全细胞催化剂的烷烃羟化酶与以下物质一起表达:各自在功能上与它相互作用的铁氧还蛋白还原酶，和在功能上与它相互作用的铁氧还蛋白。在此，它们是共表达的多肽，或是在Ν-或C-端与CYP153家族的细胞色素Ρ450单加氧酶融合的多肽。本领域技术人员可以如下容易地确定铁氧还蛋白还原酶或铁氧还蛋白与给定的CYP153家族的细胞色素Ρ450单加氧酶是否在功能上相互作用:与缺少所述3种物质中的至少一种的情况相比，在烷烃底物和所述3种多