速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT1.1及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRTI. 1及 其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 氮素是植物生长发育所必须的基本营养元素，在植物生长发育和形态建成中起着 重要作用，其对作物的生命活动和产量形成也具有重要意义。硝酸盐（N03)是作物主要的 氮源之一，硝酸盐供应量不足会严重抑制作物的生长发育。生理学研究表明，植物从±壤中 吸收N03需有一整套高-和低-亲和力NO3转运系统参加，NO3的进入由跨质膜的Η+梯度 驱动。有些Ν03转运系统是组成型表达，有的则受Ν03诱导，且随着Ν03的同化呈负反馈调 控
[0003] 矮珍珠是一种常见的透骨草科水生植物。在水中蔓延生长，生长迅速，根系发达， 茂密浓郁。在适宜的环境条件下快速蓬勃生长。仅仅用两天能够长成一对叶。
[0004] 在过去几十年中，多形汉逊酵母（Hansenulapolymo巧ha,又称Pichiaangusta)已 经成为一种公认的模式生物。广泛应用于研究甲醇代谢、硝酸盐吸收机制等。在多形汉逊酵 母中，所有与硝酸盐代谢相关的基因紧密地排列成基因簇，总长1040bp的DNA片段中大约 92%为编码DNA。多形汉逊酵母可W同化硝酸盐并把硝酸盐作为唯一氮源，它只有一个高 亲和硝酸盐转运蛋白（nitratetransporters,化t1)，可W转运硝酸盐但是不能转运氯酸 盐。YNT1结构上属于NNP(nitrate-nitriteporter)家族并且受到硝酸盐和亚硝酸盐的诱 导。汉逊酵母基因YNT1、YNR1和YNI1分别编码硝酸盐转运蛋白、硝酸盐还原酶（nitrate re化ctase)，亚硝酸盐还原酶（nitritere化ctase)，它们的表达受硝酸盐和亚硝酸盐诱导 并受按盐和谷氨酸抑致。YNT1缺失突变（Aymn可W导致菌株在硝酸盐浓度低于500iM的条件下不能转运或生长。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
[0006] 本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或C)的蛋白质：
[0007]a)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；
[0008]b)在序列表中序列5所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白 质；
[0009] C)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0010] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列5所示的蛋白质的氨基末端或 簇基末端连接上如表7所示的标签。 W11] 表7、标签的序列
[0012]
[0013] 上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为 不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述C)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0015] 上述C)中的蛋白质的编码基因可通过将序列4所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/ 或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
[0017] 本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
[0018] A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
[0019] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0020] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
[0021] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0022] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0023] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0024] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； 阳0巧]A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[00%] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0027]A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0028] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0029] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0030] 上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因： 阳03U 1)其编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DM分子；
[0032] 2)与1)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且编码上述蛋白质的 cDNA分子或基因组DNA分子；
[0033] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核巧酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分 子或基因组DNA分子。
[0034] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核巧酸序列具有75%或更高，或85% 或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机 软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比（％)表示， 其可W用来评价相关序列之间的同一性。
[0036] 上述75%或75%W上同一性，可为80%、85%、90%或95%W上的同一性。
[0037] 上述生物材料中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1 %SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每 次15min;或，0. 1XSS阳（或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0038] 本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
[0039] 本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在转运硝酸盐中的应用。
[0040] 本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在培育具有转运硝酸盐功能的 转基因酵母中的应用。
[0041] 本发明的最后一个目的是提供一种培育硝酸盐转运功能提高的转基因酵母的方 法。
[0042] 本发明提供的培育硝酸盐转运功能提高的转基因酵母的方法包括将上述蛋白质 的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母的步骤；所述转基因酵母的硝酸盐转运功能 高于所述受体酵母。
[0043] 上述方法中，所述蛋白质的编码基因为序列表中序列4所示的DNA分子。
[0044] 上述方法中，所述上述蛋白质的编码基因是通过重组载体pYNR-GeNRTl. 1导入受 体酵母的；
[0045] 所述重组载体pYNR-GeNRTl. 1为将序列表中序列4所示的DNA分子插入pYNR-EX 载体的speI和salI酶切位点间，且保持pYNR-EX载体的其他序列不变得到的载体。
[0046] 上述方法中，所述受体酵母为Δ ynt-Leu双突变多形汉逊酵母。
[0047] 本发明从矮珍珠中克隆了一个硝酸盐转运蛋白的编码基因GeNRTl. 1，并将该基因 导入Δynt-Leu双突变多形汉逊酵母中，得到转GeNRTl. 1酵母。通过试验证明：GeNRTl. 1 蛋白具有硝酸盐转运蛋白的功能，能提高植物的氮素利用效率，使植物快速生长。
【附图说明】 W48] 图1为高亲和硝酸盐转运蛋白基因（GeNRTl. 1)的克隆。
[0049] 图2为硝酸盐转运蛋白基因的3' RACE。
[0050] 图3为硝酸盐转运蛋白基因的5' RACE。
[0051] 图4为pYNR-GeNRTl. 1穿梭载体的双酶切验证。
[0052] 图5为转基因酵母Δ ynt-GeNRTl. 1的PCR验证。
[0053] 图6为GeNRTl. 1基因功能的验证。
[0054] 图7为GeNRTl. 1的硝酸盐吸收速率图。
【具体实施方式】 阳化5] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0056] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057] 下述实施例中的矮珍珠在文献"DonaldH.Les，Introductionof Glossostogma(Phrymaceae)toNorthAmerica:ataxonomicandecologicaloverview， 2006"中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。 W58] 下述实施例中的Δynt-Leu双突变多形汉逊酵母在文献"化seMartin,FunctionalcharacterizationoftheArabidopsisthaliananitratetransporter CHLlintheyeastHansenulapolymo;rpha，2008"中公开过，公众可从中国农业科学院生物 技术研究所获得。
[0059]