棉花内生真菌cef-082及其在棉花黄萎病防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病理学，具体地设及棉花的内生真菌CEF-082及其在棉花黄萎病 防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 棉花是关系国计民生的重要战略物资。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的±传维 管束真菌病害，是我国乃至世界棉花生产上的最主要病害，被称为棉花的"癌症"，在我国棉 花生产上经常大面积重度发生，一般减产15% -30%，重病田减产50%W上，甚至绝产。由 于轮作倒巷难，缺乏抗病品种和具有较好防治效果的农药，致使目前生产上对黄萎病的防 治几乎是空白，病害的发生危害日趋严重，成为发展棉花生产的主要限制因子之一。
[0003] 利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、环境友好的特点。生防菌通 常可利用竞争、抗生、寄生和交叉保护等直接的括抗机制抑制植物病害；同时某些生防菌 还能促进植物生长，诱导植物对真菌、细菌和病毒引起的病害乃至对线虫和昆虫为害的抗 性，称为诱导系统抗性（ISR)，又称获得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺 激或作用下，产生对随后病原物侵染的抗性。诱导的系统抗病性（或免疫作用）优于化学 防治和抗病育种，其优点如下：（1)免疫作用能有效地防治病毒、细菌和真菌病害。（2)免疫 作用是稳定的，它决定几种不同的机制，而内吸杀菌剂往往具有单一的作用位点，容易产生 新的抗药小种，因而是不稳定的。（3)免疫作用是系统的、持久的，瓜类中的免疫作用可通过 嫁接，从化木传导到接穗。（4)在感病植物中亦具有免疫能力，说明潜在的抗病基因存在于 所有的植物中。（5)免疫物质，可从免疫植株的化学提取物中获得，可在田间喷施或种子处 理。
[0004]目前利用括抗微生物防治棉花黄萎病研究较多的是枯草芽抱杆菌，作用机理是产 生杆菌肤等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具有一定的效果，但是在生产应 用中存在不少问题，其中最主要的问题是防治效果较低，国内登记的枯草芽抱杆菌剂型对 棉花黄萎病的防治效果在45%左右，且在不同年份效果不稳定。例如2008年和2009年，由 中国农业科学院棉花研究所承担国家农药登记试验中（任务来源于农业部农药鉴定所）， 黑龙江强尔生化技术开发区有限公司生产的1000亿活芽抱/克枯草芽抱杆菌可湿性粉 剂对棉花黄萎病的防治效果为46. 0% -52. 9%，但在2010年大面积试验中防治效果只有 32. 7%。
[0005] 植物内生真菌是那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种 组织和器官内部、不引发植物产生明显病症的真菌。因为能够产生次生代谢类物质防治植 物病害，现已成为生物防治中重要的生防因子。棉花黄萎病是一种系统性维管束病害，病 原菌从植株的根部入侵，沿维管束扩展蔓延，棉花的内生真菌与黄萎病菌同处植物体内，具 有相同的微生态环境，内生真菌的代谢产物可直接作用于黄萎病菌，因此，从棉花的内生真 菌入手，分离筛选对黄萎病菌具有抑制活性的菌株，获得对该病控制效果好的生防菌株，是 值得探讨的棉花黄萎病防治的新途径。本发明的发明人经多年的研究，从健康棉花的茎杆 中获得一株内生真菌，经溫室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达64. 63%，对棉花黄萎病 的防治具有巨大的潜能。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明人为解决现有的括抗微生物防治棉花黄萎病效果较差的问题，提出 并完成本发明。
[0007] 本发明的目的是提供棉花的内生真菌CEF-082。
[000引本发明的再一目的是提供上述棉花的内生真菌CEF-082的应用。
[0009] 本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、抑菌测定及溫室的生物测 定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株CEF-082。
[0010] 根据本发明的棉花内生真菌CEF-082,该菌株是一种球毛壳菌。在分离时，首先要 选择健康的棉株，最重要的是，在分离过程中，一定要保证样品的表面消毒彻底，确保分离 到的是棉花的内生真菌。
[0011] 本发明获得的生防菌株CEF-082来自棉株体内，将生防菌株经过查彼克液体培养 基培养后，过滤菌丝及抱子，然后将滤液接到棉花根部，或者将生防菌的玉米沙粒培养物加 入基质中培育棉苗。能够增强棉花对黄萎病的抗病性。
[0012] 该菌株经鉴定是一株球毛壳真菌（化aetomiumglobosum)。从棉花中可W分离到 丰富的内生真菌。由于微生物的培养性状容易受培养条件的影响，传统的W形态学为基础 的分类鉴定有时候会受到限制。分子生物学的发展给微生物的分类鉴定提供了新的有效措 施，因此，W传统的形态学鉴定为基础，结合分子生物学的手段，对筛选到的菌株进行鉴定， 最后获得目的菌株。
[0013] 利用棉花的内生真菌CEF-082来控制棉花黄萎病在W下五方面产生有益效果。
[0014]UCEF-082能够在人工培养基上培养，容易获得和培养。用于生物防治的菌株必 须能够在人工培养基上培养，W利于工厂化生产和推广应用。CEF-082是一株棉花的内生真 菌，在±壤中广泛存在，有报道球毛壳菌能够有效控制制玉米小斑病、黄瓜灰霉病和辣椒疫 病等农作物病害。该菌株在PDA、查氏及玉米沙粒培养基上生长良好，有利于大量繁殖和推 广应用。
[0015] 2XEF-082对棉花黄萎病菌具有较好的抑制效果。在PDA培养基上，CEF-082产生 的非挥发性代谢物对黄萎病菌菌落生长的抑菌效果为100%，对分生抱子产量的抑制率为 70. 73%。
[0016] 3XEF-082对黄萎病控制效果好。在棉苗真叶初现时用CEF-082培养滤液预接种 棉花（每鉢50ml)，对黄萎病的防治效果为62. 37% ;将CEF-082的玉米沙粒培养物按2% 接入基质中，对棉花黄萎病的防治效果为66. 88%;两种方法平均防治效果为64. 63%。
[0017] 4XEF-082对黄萎病菌具多种作用方式，施用方法灵活。CEF-082的培养滤液预接 种棉花可W显著提高棉株内防御相关基因的表达，提高棉花的抗病性，从而有效控制黄萎 病危害，该作用方式表明CEF-082可用于研制植物疫苗，采用滴灌方式防治棉花黄萎病；同 时，将CEF-082的玉米沙粒培养物风干后（有效成分为菌丝体和抱子），按2%接入基质后， 对棉花黄萎病具有很好的控制作用，该作用方式可用于研制微生物肥料。
[0018] 5XEF-082为环境友好型生防菌株。CEF-082属于子囊菌亚口、核菌纲、球壳目、黑 抱壳科、毛壳菌属，在自然界中广泛存在，并对±壤中的有害微生物产生括抗作用。本发明 获得的菌株CEF-082分离自棉花，对多数的作物不致病，并且有较强的纤维素降解能力，解 决了具有生防潜力的微生物可能转变为致病菌的问题，因此对人畜、昆虫和作物安全，环境 友好。
【附图说明】
[0019] 图1为CEF-082在PDA上的菌落形态，其中由左至右依次为正面、反面和显微镜下 观察到的球毛壳及抱子。
[0020] 图2圆盘虑膜法测定CEF-082对棉花黄萎病菌的抑制作用。曰，对照，直接在PDA 平板中央接种棉花黄萎病菌强致病力菌株Vd080(其保藏编号为：CGMCCNo. 5904)菌块 (直径为5mm)，25°C恒溫培养箱内培养15d;b，在平板中央接种CEF-082的菌块（直径为 5mm)，25°C恒溫培养箱内培养7d后去玻璃纸，再在平板中央接种黄萎病菌Vd080菌块（直 径为5mm)，25 °C恒溫培养箱内培养15d。
[002。 图3CEF-082对棉花黄萎病的控制作用。a,真叶初现（播种后18天左右），将查 彼克培养基（不含CEF-082) 50mL薩根棉苗，4天后（一片真叶平展）接种大丽轮枝菌强致 病力菌株Vd080 ;b，真叶初现（播种后18天左右），薩根接种CEF-082的查彼克培养滤液 50mL，4天后接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080。C，基质中只接入2%的玉米沙粒培养基， 一片真叶平展时接种Vd080 ;基质中接入2%CEF-082玉米沙粒培养物，一片真叶平展时接 种Vd080。
[0022] 球毛壳（Chaetomiumglobosum)CEF-082,于2015年9月14日保存于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCCNo. 11313。
【具体实施方式】
[002引实施例1 :菌株的分离[0024] (1)样品采集
[00巧]于6-8月份，选择健康棉株，取主茎的中上部及果枝15畑1。
[002引 似菌株的分离
[0027] 先将采集到的样品（棉花茎杆）用清水洗净，去皮，置于直径为9cm的灭菌的培养 皿中，用75 %的酒精消毒Imin。再用5.0%的次氯酸钢进行消毒60s，用灭菌水洗3次，每 次时间不少于3min。然后用灭菌的吸水纸沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0. 4cm长的 小段，置于9cm的培养皿中，25°C培养。用最后一遍清洗液为对照，检查消毒是否彻底。每 天检查内生真菌的生长情况，发现有菌落长出，及时转移至直径为6cm的培养皿中培养，然 后观察其菌落大小、颜色、表面特征、质地。
[0028] (3)CEF-082 的特征
[0029] 1、形态特征在PDA平板上，刚开始呈绒状生长，栋色，后颜色加深，且菌丝上长有 褐色小颗粒状的物质，反面开始为栋色，继续培养颜色变深，呈黄褐色。显微镜下（400X) 该菌株产生球毛壳，其内为分生抱子（图1)。
[0030] 2、生理特征CEF-082在5-30°C条件下均能生长，最适生长溫度是25°C。依据 CEF-082形态特征、生理特征和分子鉴定结果，CEF-082被鉴定为球毛壳菌（化aetomium globosum)，属于子囊菌亚口、核菌纲、球壳目、黑抱壳科、毛壳菌属（图1)。
[0031] (4)培养基及培养条件
[003引1.PDA培养基马铃馨200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然抑。称取削 皮的200g马铃馨，切成小块置于锅中加水煮烂（煮沸20-30min)，用纱布过滤后，滤液中加 入葡萄糖和琼脂继续加热揽匀，稍冷却后再补水至1000ml，分装到锥形瓶，加塞包扎后灭菌 20min(0. 235MPa，121°C)。25°C，黑暗培养 7d。
[0033]2.查彼克（Czapek)液体培养基KN03,2.OOg;K2HP〇4，l.3lg;KCI，0. 5〇