肝炎疫苗致敏树突状细胞诱导特异性t细胞的构建方法

文档序号:9611684阅读:804来源:国知局
肝炎疫苗致敏树突状细胞诱导特异性t细胞的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物领域,具体涉及一种肝炎疫苗致敏树突状细胞诱导特异性τ细胞的构建方法。
【背景技术】
[0002]慢性HBV(乙肝病毒)感染依然是肝癌和终末期肝病发生进展的首要因素。现有治疗药物难以清除病毒,临床治愈率极低,停药后复发率高,需要终身治疗。慢性HBV感染的核心理论为特异性T细胞功能不全导致机体对病毒的免疫耐受。
[0003]树突状细胞(DC)是T细胞活化的关键启动者,是体内最强的抗原提呈细胞,担负T细胞成熟、活化、增殖的启动作用,而慢乙肝患者DC数量或功能缺欠使T细胞激活受阻,导致病毒长期存活并复制,而恢复DC功能对T细胞功能有增强作用;因此,通过体外定向培养获得自体来源的DC细胞诱导特异性T细胞,从而激活细胞免疫、天然免疫和后续的体液免疫,对体内HBV进行靶向精确攻击,促进病毒清除,将有望突破治愈难关。近年来一些临床研究使用DC疫苗治疗慢乙肝能一定程度抑制病毒,提示改善抗原提呈促进功能性T细胞具有潜力和前景,综合慢乙肝免疫耐受微环境的诸多因素,深入探讨调动抗原提呈对T细胞影响作用可能踏上慢乙肝治愈之路。

【发明内容】

[0004]本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题,提供一种能够高效率提呈病毒抗原的肝炎疫苗致敏树突状细胞诱导特异性T细胞的构建方法。
[0005]本发明的另一个目的是提供利用该方法制得的体外细胞体系。
[0006]本发明的再一个目的是提供包含体外细胞体系细胞制剂。
[0007]本发明的再一个目的是提供该方法在制备用于治疗肝炎的细胞制剂中的用途。
[0008]为了实现以上目的,本发明提供了一种肝炎疫苗致敏树突状细胞诱导特异性T细胞的构建方法,其包括如下步骤:
[0009](1)获得抗原负载单核细胞衍生树突状细胞;
[0010](2) T细胞扩增;
[0011](3)获得肝炎病毒特异性T细胞。
[0012]优选地,所述步骤⑴为:采集外周血10ml,分离外周血单个核细胞,重悬于4ml的A頂-V培养液,然后置于37 °C、50 % C02培养箱中贴壁培养2小时;2小时后取出,轻摇,移走悬浮细胞,贴壁细胞,即单核细胞中加入4ml AIM - V培养基,该培养基内含浓度为20ng/ml的IL - 4(白介素-4)以及浓度为100ng/ml的GM - CSF(巨噬细胞-集落刺激因子);3天后,单核细胞补充AIM - V培养液2ml,该培养液含浓度为20ng/ml的IL - 4以及浓度为100ng/ml的GM -CSF,仍置于37°C、50% C02培养箱中培养,使其诱导成熟为单核细胞衍生树突状细胞(moDCs细胞);第6天时向moDCs细胞加入肝炎病毒疫苗原液10 μ g,培养24小时,获得抗原负载单核细胞衍生树突状细胞(HPDCs细胞)。
[0013]优选地,所述步骤(2)为:将步骤(1)中获得的悬浮细胞,即T细胞,移至含4mlAIM - V培养液的T75培养瓶,以A頂-V培养基洗涤3次,洗涤液量为2ml/次;然后加入终浓度为1 μ g/ml的0KT3 (⑶3单克隆抗体)以及终浓度为1 μ g/ml的抗-⑶28,置于37 °C、50% C02培养箱中培养;第2天:T细胞培养液中补充AIM - V培养液5 - 10ml,该培养液内含浓度为300IU/ml的IL - 2(白介素-2)以及质量体积浓度为20%的白蛋白1.5ml ;第4天:补充A頂-V培养液5 - 10ml,该培养液内含浓度为300IU/ml的IL - 2以及质量体积浓度为20%的白蛋白1.5ml,继续在37°C、50% C02培养箱中培养至第8天,获得增殖的T细胞。
[0014]优选地,所述步骤(3)为:将步骤(1)中获得的抗原负载单核细胞衍生树突状细胞和步骤⑵中获得的增殖的T细胞混合共培养;第10天:补充A頂-V培养液5 - 10ml,该培养液内含浓度为300IU/ml的IL-2以及质量体积浓度为20%的白蛋白1.5ml ;第12天:补充A頂-V培养液5 - 10ml,该培养液内含浓度为300IU/ml的IL - 2以及质量体积浓度为20%白蛋白1.5ml ;第14天:获得肝炎病毒特异性T细胞。患者外周血10ml进行定向诱导DC产生特异性T细胞数量达107 - 10s。
[0015]更优选地,所述的肝炎疫苗为甲肝疫苗、乙肝疫苗或丙肝疫苗中的任意一种。更优选地,所述的肝炎疫苗为乙肝疫苗。
[0016]本发明还提供了根据上述方法制得的体外细胞体系。
[0017]本发明还提供了包含上述体外细胞体系的细胞制剂。
[0018]本发明还提供了根据上述方法在制备用于治疗肝炎的细胞制剂中的用途。
[0019]优选地,所述肝炎为甲肝、乙肝或丙肝中的任意一种。更优选地,所述肝炎为乙肝。
[0020]具体地,本发明公开了肝炎疫苗(特别是乙肝疫苗)致敏树突状细胞(DC)诱导特异性T细胞(HPDCT)的构建方法,利用外周血单核细胞通过定向诱导获得功能性的成熟DC,再通过过继免疫诱导出HBV特异性多表位的CD4+T细胞和CD8+T细胞;所述的T细胞能分泌高水平的效应性细胞因子IL - 17、IL - 2、IFN - γ。
[0021]本发明首先制备患者自体来源的活化DC细胞,利用患者外周血PBMC,分离单核细胞后,利用细胞因子白介素-4(IL - 4)和集落刺激因子(GSF)诱导获得功能性DC,以多色流式细胞鉴定DC成熟标记;然后以去佐剂的乙肝疫苗冲击,获得表面抗原致敏的DC。
[0022]平行实验进行T细胞扩增,使用0KT3和抗-⑶28建立和优化淋巴细胞扩增培养体系,体外培养7天后,再与负载表面抗原的成熟DC混合培养,从而获得HBV特异性IFN - γ和Τ细胞。
[0023]本方法制得的体外细胞系可显著改善患者的特异性细胞免疫,将制得的体外细胞体系回输患者体内,从而靶向攻击体内HBV,降解病毒基因和清除受感染的肝细胞,为慢性乙肝治愈提供新的途径。
[0024]比较联合抗病毒药物叠加HPDCT细胞治疗与单用药物或单用细胞治疗效应性Τ细胞和细胞因子的差异。结果发现,抗病毒药物治疗患者单核细胞衍生树突状细胞诱导特异性Τ细胞分泌IFN - γ水平高于无抗病毒治疗的慢乙肝患者。抗病毒药物叠加HPDCT细胞治疗具有更尚的抗病毒效应。
【附图说明】
[0025]图1示出了含成熟标记的单核细胞衍生树突状细胞。
[0026]图2示出了抗原负载树突状细胞诱导较高水平特异性T细胞。
[0027]图3示出了抗原负载树突状细胞诱导较高水平IFN - γ。
[0028]图4示出了抗病毒药物叠加HPDCT显示更强的抗病毒效应。
[0029]图5示出了 ETV单药治疗和ETV+HPDCT联合治疗流程。
[0030]图6示出了 ETV联合HPDCT治疗组患者产生对降解病毒起关键作用的Τ细胞效应因子(IL- 17和IFN - γ )显著高于ETV单药治疗。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和具体实施例,对本发明的技术方案作进一步的详述,但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。以下天数的表述,如未特别指出,均从开始构建时计算。
[0032]实施例1:获得抗原负载单核细胞衍生树突状细胞
[0033]采集慢性乙肝患者外周血10ml,按照常规方法分离外周血单个核细胞(PBMC),重悬于4ml的A頂-V培养液,然后置于37°C、50% (体积浓度)C02培养箱中贴壁培养2小时。
[0034]2小时后取出,轻摇,移走悬浮的非贴壁细胞,贴壁细胞中加入A頂-V培养基4ml,该培养基内含 IL - 4(20ng/ml)及 GM - CSF (100ng/ml)。
[0035]3天后,贴壁细胞补充A頂-V培养液2ml,该培养液内含IL - 4(20ng/ml)及GM -CSF(100ng/ml),仍置于37°C、50% (体积浓度)0)2培养箱中培养。
[0036]第6天
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