一种利用搅拌式生物反应器制备猪流行性腹泻病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种利用搅拌式生物反应器制备猪流行性腹泻病毒的方法。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度接触性传染病，其临床特征表现为仔猪呕吐、腹泻和脱水，病理变化主要表现在猪的空肠和回肠部分的肠绒毛萎缩和脱落，各种年龄猪均可发病，对哺乳仔猪危害最为严重，给养猪业带来重大经济损失。
[0003]目前，国内猪流行性腹泻病毒的培养主要是转瓶培养方式，VeroE6细胞增殖速度缓慢，由于培养过程中PH值、溶氧和培养基营养的不可检测等条件限制，难以实现对细胞生长密度的最优控制，从而导致病毒滴度较低，生产过程中劳动强度大，批间差异大，产品的质量很难达到稳定。采用规模化的生物反应器有望改善上述缺陷，然而由于不同细胞株、毒株具有完全不同的生物学特性，因此在利用生物反应器执行猪流行性腹泻制备的过程中缺乏一种普遍性的操作方法，也就是说，针对不同细胞株、毒株需要设计特定的培养条件。此外，相对于转瓶培养而言，生物反应器培养猪流行性腹泻病毒的规模较大，可控参数较多，因此如何在此规模基础上保证细胞的增殖速率、病毒的效价，现有技术中尚未形成有效方法。
【发明内容】
[0004]本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种利用搅拌式生物反应器制备猪流行性腹泻病毒的方法，以解决现有技术中转瓶培养所存在的自动化程度低、质量不稳定的技术问题。
[0005]本发明要解决的另一技术问题是转瓶培养方法所得猪流行性腹泻病毒效价较低。
[0006]本发明要解决的再一技术问题是利用生物反应器制备猪流行性腹泻病毒时如何保证质量稳定。
[0007]本发明要解决的又一技术问题是利用生物反应器制备猪流行性腹泻病毒时如何提升病毒效价。
[0008]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]—种利用搅拌式生物反应器制备猪流行性腹泻病毒的方法，包括以下步骤:
[0010]1)在搅拌式生物反应器内，将微载体以2?10g/L的用量与细胞生长液混合，得到混合培养基，而后向其中接入0.3?1 X 106CFU/mL的Vero细胞，而后在pH6.6?7.5、温度35?38°C、溶氧40?80%、搅拌转速30?90rpm条件下培养；
[0011]2)当混合培养基中细胞密度达到2?5X106CFU/mL时，弃去混合培养基中的细胞生长液，加入细胞维持液，接入0.1?10M0I的猪流行性腹泻病毒，而后在pH 7.0?7.4、温度36?37°C、溶氧35?60%、搅拌转速35?55rpm条件下培养；
[0012]3)病毒接种后培养30?45h时，收获培养液，冻融后即得到猪流行性腹泻病毒液。
[0013]作为优选，步骤1)所述细胞生长液是含有8?12% (v/v)新生牛血清的DMEM培养基；更优的，其中新生牛血清含量是10% (v/v)。
[0014]作为优选，所述微载体是Cytodex系列微载体。
[0015]作为优选，所述搅拌式生物反应器的容积为14L。
[0016]作为优选，步骤1)中用于培养的pH条件为6.8?7.2 ;更优的，pH是7.0。
[0017]作为优选，步骤1)中用于培养的温度条件为37?38°C。
[0018]作为优选，步骤1)中用于培养的溶氧条件为40?60%。
[0019]作为优选，步骤1)中用于培养的搅拌速度为35?55rpm。
[0020]作为优选，步骤2)所述的细胞维持液是含有1?3% (v/v)新生牛血清的DMEM培养基；更优的，其中新生牛血清含量是2% (v/v)。
[0021]作为优选，步骤2)中弃去混合培养基中的细胞生长液时Vero细胞的累计培养时间为72?120ho
[0022]作为优选，步骤3)中收获培养液时，与微载体相脱落的Vero细胞数量达到Vero细胞总量的70%以上。
[0023]作为优选，步骤3)中所述冻融，其冷冻温度是-40°C。
[0024]作为优选，步骤3)中所述冻融，重复3次。
[0025]作为优选，病毒收获后可以进一步执行病毒含量检测，病毒含量可以是通过以下方法检测的:利用TCID5。方法进行病毒含量测定，病毒TCID5。测定时，将经胰蛋白酶-EDTA消化分散的Vero细胞悬液每孔100 μ L (细胞含量为3 X 105/mL左右)加入到96孔细胞培养板中，过夜培养；用含有2%血清的DMEM维持液将猪流行性腹泻病毒液连续10倍稀释，即10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8，每个稀释度取100 μ L加入到含有过夜培养的Vero细胞的96孔细胞培养板的孔中，每个稀释度8个重复，并设正常细胞培养对照，置5% C02培养箱中，37°C培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2?5日，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID5。。本发明应用搅拌时生物反应器培养猪流行性腹泻病毒毒价可达到107.5?10s'3TCID5Q/mL。
[0026]在本发明技术方案中，所述搅拌式生物反应器是指以搅拌方式实现培养液流动的生物反应器，例如可以是具有机械搅拌桨的细胞培养罐。所述Cytodex系列微载体，仅限定于由GE公司出品的、型号为Cytodex的一系列微载体产品。
[0027]本发明利用了搅拌式生物反应器操作范围较大、混合性良好以及浓度均匀等优点，通过桨式搅拌器来搅动培养液，以增加质传效果，确保培养液的养分和溶氧浓度的均匀分布，达到大规模培养细胞的目的。和其他生物反应器相比，其结构简单、成本较低。
[0028]在此基础上，本发明结合猪流行性腹泻病毒和Vero细胞的生物学特性，从微载体加入量、细胞接种密度、病毒接种量、病毒接种时细胞密度、收毒时间及反应器操作参数等角度匹配了适宜的条件，从而显著提升了病毒培养效率。与传统工艺相比，本发明方法自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，生产用地少，成本低，规模易于扩大；生产病毒滴度高，产品质量稳定，批间差异小。
【具体实施方式】
[0029]以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0030]以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10%)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0031]除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0032]以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0033]实施例1
[0034]生物反应器:德国贝朗公司14L生物反应器。
[0035]微载体:Cytodex_l (购自GE公司)。
[0036]猪流行性腹泻病毒:PEDV ZJ08株或CV777毒株。
[0037]细胞生长液:含体积浓度为10%新生牛血清的DMEM ;
[0038]细胞维持液:含体积浓度为2%新生牛血清的DMEM ;
[0039]细胞培养:在14L生物反应器内，按照2g/L的浓度加入预先处理的Cytodex-Ι，水化后，用PBS洗2-3次，高压灭菌，接种Vero细胞，细胞接种浓度为40-60万/mL，细胞培养的反应器最佳设定参数为PH7.0、温度37°C、溶氧40%、搅拌速度为35rpm/min。细胞接种后定时取样显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，根据葡萄糖消耗情况及细胞生长和脱落情况，48h左右进行细胞换液，换液后定时取样显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，根据葡萄糖消耗情况及细胞生长和脱落情况，72h左右进行二次换液，继续培养细胞，定时进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，96h进行3次换液，继续培养细胞，当细胞密度达到200万/mL左右时停止细胞换液。
[0040]病毒接种和培养:当细胞密度达到200万/mL时，更换细胞维持液，接种猪流行性腹泻病毒，病毒接种量为10M0I，病毒繁殖的反应器最佳设定参数为pH7.2、温度36.5°C、溶氧35%、搅拌速度为35rpm/min。病毒接种后，定时取样，进行细胞状态观察和病毒含量测定。
[0041]病毒液收获和病毒含量测定:根据细胞病变情况及病毒含量测定情况，病毒接种后30_45h，当微载体的细胞大部分脱落，停止培养，收获病毒液，于_40°C冻融三次，得到猪流行性腹泻病毒(PEDV)，测定病毒含量为107.°7.4Τ(Π?5。。
[0042]实施例2
[0043]生物反应器:德国贝朗公司14L生物反应器。
[0044]微载体:Cytodex_l (购自GE公司)。
[0045]猪流行性腹泻病毒:PEDV ZJ08株或CV777毒株。
[0046]细胞生长液:含体积浓度为10%新生牛血清的DMEM ;
[0047]细胞维持液:含体积浓度为2%新生牛血清的DMEM ;
[0048]细胞培养:在14L生物反应器内，按照5g/L的浓度加入预先处理的Cytodex-Ι，水化后，用PBS洗2-3次，高压灭菌，接种Vero细胞，细胞接种浓度为60-80万/mL，细胞培养的反应器最佳设定参数为pH7.0、温度37、溶氧35%、搅拌速度为45rpm/mi