一种防治鸡球虫病的chp317基因、疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程技术领域，尤其设及一种柔嫩艾美耳球虫保守蛋白化 CHP317基因，并利用运种基因制备的疫苗、相应的制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 鸡球虫病是几种艾美耳球虫寄生肠道所引起的一种危害极其严重的全球性寄生 虫病，严重危害鸡的生长发育，是集约化养鸡业危害最大的疾病之一，每年给养鸡业造成巨 大的经济损失。柔嫩艾美耳球虫巧imeriatenella)是致病性最为严重的鸡球虫之一，它 主要寄生于盲肠及其附近区域，能够引起出血性肠炎，对维鸡危害最大，严重时能引起较高 的死亡率。目前控制鸡球虫病的方法主要W在饲料中添加抗球虫药物预防为主，但由于抗 球虫药的长期使用，鸡球虫耐药性的产生已成为无法避免的问题，任何一种抗球虫药在使 用一定时间后都会引起球虫的耐药性，使得许多抗球虫药的防治效果显著降低，甚至完全 失效，即使提高药物浓度也无济于事，仍然爆发球虫病，给养鸡业带来了无法弥补的损失。 同时因球虫产生耐药性，使好不容易筛选出来的抗球虫药使用年限大大缩减，新药开发速 度已赶不上耐药株出现的速度。而且抗球虫药作为饲料添加剂的潜在危害又逐渐成为人们 关注的对象，食品安全日益受到关注，很多曾经效果很好的抗球虫药都被划入禁用之列，因 此，人们期待用更理想的方法来替代抗球虫药物的使用。球虫活卵囊疫苗的成功研制和应 用提供了一种可W替代药物控制鸡球虫病的技术手段。但活疫苗不可避免地存在难保存、 散毒及潜在的致病威胁等缺点，未能在鸡场得到广泛使用，所W迫切需要寻找新的防治手 段来控制鸡球虫病。而研制新疫苗和新药物的关键在于寻找到合适的虫体抗原基因或基因 产物作为防治球虫病的作用祀标。
[0003] 鸡球虫是属于顶复器口（Apicomplexa)艾美耳属巧imeria)的一类寄生于鸡肠 道的原虫。顶复器原虫多数是专一性的细胞内寄生虫，包括追原虫（Plasmodium)、弓形虫 (Toxoplasma)、艾美耳球虫巧imeria)、隐抱子虫（Cryptosporidium)等，有复杂的生活史， 需入侵宿主细胞，完成生活史循环需要更替一个或多个宿主，或更换不同的细胞和组织，因 而成功地入侵宿主细胞是运类寄生虫感染建立的前提。虽然顶复器原虫入侵的宿主细胞不 同，包括红细胞、淋己细胞、巨隧细胞和消化道细胞等，但都有一个共同的高度保守的入侵 机制，需要顶复器（微线、棒状体和致密颗粒）分泌一系列蛋白参与，运些蛋白相互作用，在 宿主细胞膜与虫体表面形成一个高度保守的运动结构（Moving化nction，MJ)，对虫体入侵 宿主细胞起至关重要的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决针对药物防治球虫病极易产生耐药性的问题急需开发新型疫苗和 新药的技术问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫保守蛋白化CHP317基因，该化CHP317在柔嫩 艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中起着重要作用，对开发防治鸡球虫病的新疫苗或新药具有 很高的应用价值。
[0005] 此外，本发明提供一种携带柔嫩艾美耳球虫保守蛋白化CHP317基因的疫苗。
[0006] 此外，本发明提供一种防治鸡球虫病的疫苗的制备方法：将柔嫩艾美耳球虫保守 蛋白化CHP317的成熟肤与原核表达系统或真核表达系统的表达载体相连获重组表达载 体，再将重组表达载体转入大肠杆菌或毕赤酵母细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，即得 防治鸡球虫病的疫苗。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] 在本发明的一个方面，利用5'RACE和3'RACE首次扩增了柔嫩艾美耳球虫化 CHP317基因的全长序列，如沈QIDNO. 2所示。
[0009] 该序列全长llOSbp，除了 0RF(71-57化P)与NCBI柔嫩艾美耳球虫推测的特意蛋 白100%同源外，该序列还包括5'的UTR序列，长7化口，含有CAAT序列，没有TATA序列；3' 端UTR序列，长43化P，含poly(A)尾，没有典型的AATAAA序列。其中5' -UTR和3' -UTR， 可通过一些调控因子的结合来对该基因的表达进行调控。mRNA分子的5'UTR通过其长度 和碱基顺序W及二级结构等来参与表达调控。其中5'-UTR主要参与翻译调节，影响转录后 的各个阶段，包括mRNA的稳定，折叠和核糖体的相互作用；3'-UTR影响RNA的水平，从而影 响翻译后蛋白的表达量，因此，5' -UTR和3' -UTR在真核生物基因的转录、翻译和表达过程 中发挥重要作用。
[0010] 优选的，本发明同时提供了柔嫩艾美耳球虫化CHP317的开放阅读框核巧酸序 列；
[0011] 优选的，本发明同时提供了柔嫩艾美耳球虫化CHP317的开放阅读框编码的氨基 酸序列，如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，包含柔嫩艾美耳球虫化CHP317的开 放阅读框核巧酸序列。
[0013] 所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表 达载体、重组真核表达载体。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经 表达而制得。
[0015] 在本发明的另一方面，还提供了一种多克隆抗体，该多克隆抗体是用上述重组蛋 白免疫兔子而制得。
[0016] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于制备 预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。
[0017] 所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子抱子入侵宿主细胞而阻断球虫生活 史来发挥作用。
[0018] 优选的，本发明提供一种防治鸡球虫病的疫苗的制备方法：将柔嫩艾美耳球虫保 守蛋白化CHP317的成熟肤与大肠杆菌或毕赤酵母细胞的表达载体相连获重组表达载体， 再将重组表达载体转入大肠杆菌或毕赤酵母细胞宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，即 得防治鸡球虫病的疫苗。
[0019] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于筛选 预防或治疗球虫病的药物。
[0020] 在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述重组蛋白，或上述重组载体， 该重组载体为真核表达载体。
[0021] 在本发明的另一方面，还提供了一种作用祀标为化CHP317蛋白的抗球虫药物。
[0022] 本发明柔嫩艾美耳球虫保守蛋白化CHP317基因，是柔嫩艾美耳球虫巧imeria tenella)的一个新基因。Western-blot分析表明本发明化CHP317的原核表达产物和真核 表达产物都具有良好的免疫原性；免疫巧光定位实验和体外抑制试验结果显示化CHP317 与子抱子的入侵相关，在球虫子抱子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本发明的化 CHP317基因，为开发抑制子抱子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。
【附图说明】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0024] 图1是本发明实施例1柔嫩艾美耳球虫化CHP317基因扩增产物电泳鉴定图；
[00巧]Μ:标准DNA分子量（从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，lOObp) ;1 :扩增的317基因。
[0026] 图2是本发明实施例2实时定量PCR检测化CHP317基因在柔嫩艾美耳球虫不同 发育阶段的表达图；
[0027] U0代表柔嫩艾美耳球虫未抱子化卵囊；SO为柔嫩艾美耳球虫抱子化卵囊；Spz为 柔嫩艾美耳球虫子抱子;Mrz为柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子。
[0028] 图3是本发明实施例3重组原核表达质粒祀T-EtCHP317的双酶切鉴定图；"1" 代表重组表达质粒祀T-EtCHP317的BamHI、化0I双酶切产物。
[0029] 图4是本发明实施例3重组表达质粒祀T-EtCHP317不同时相表达蛋白的 SDS-PAGE电泳图；
[0030]Μ:蛋白质标准分子量（从上至下为94.OkDa、66.沈0日、45.OkDa、35. OkDa、 26. OkDa) ;1:未加IPTG诱导的化菌液；2-5:分别为化、地、化、她的表达产物。
[0031] 图5是本发明实施例3纯化的化CHP317重组蛋白分析图；
[0032]M:蛋白质标准分子量（从上至下为94. OkDa、66.沈0日、45. OkDa、35. OkDa、 26. OkDa) ;1:纯化的重组蛋白His-Et CHP317蛋白。
[0033] 图6是本发明实施例5的化CHP317蛋白免疫原性分析图；
[0034]Μ:预染的蛋白质标准分子量（从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、 43kDa、34kDa、26kDa、17kDa) ;1:柔嫩艾美耳球虫卵囊全蛋白免疫兔子的抗血清；2