一种高特异性检测样品中靶dna的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种高特异性检测样品中祀DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 核酸的分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之 一，它是互补的核巧酸序列通过Walson-化ick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA。由 于分子杂交技术具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已被 广泛地应用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测 和疾病的诊断等方面。它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的 应用也日趋增多。
[0003] 分子杂交的双方是所使用探针和要检测的祀核酸。祀核酸可W是克隆化的基因组 DNA，也可W是细胞总DNA。探针必须经过标记，W便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物 是同位素，但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
[0004] 生物素标记法是一种重要的非同位素标记探针方法。该方法是将生物素连接在核 酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，在分子杂交反应完成之后用亲和素 对分子杂交结果进行检测。生物标记探针虽然稳定、不失活，但是在杂交反应的过程中，亲 和素W及标记探针都容易非特异性地直接吸附到固相支持物的表面，严重时将产生较高的 杂交背景，导致假阳性的检测结果，送制约了非同位素标记探针方法在检测祀核酸中的广 泛应用。
[0005] 出于送种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴 露出来的问题，期望提供一种高特异性地检测样品中祀DNA的方法，在提高祀DNA检测效率 的同时能够有效避免检测的假阳性情况。本发明还期望提供一种高特异性检测样品中祀 DNA的方法在检测高危型人乳头瘤病毒中的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种高特异性检测样品中祀DNA的方法。该方法一方 面将DNA分子杂交过程与碱性磯酸酶联过程合二为一进行，另一方面通过预处理、前处理 和后处理对杂交反应前后的固相支持物表面进行协同配合处理，不仅提高了样品中祀DNA 的检测效率，而且提高了固相支持物表面DNA分子杂交的特异性，有效避免了检测结果的 假阳性。
[0007] 本发明的又一目的在于提供所述方法在检测人乳头瘤病毒中的应用。
[0008] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种高特异性检测样品中祀DNA的方法， 其包括如下步骤：
[0009] A)预处理步骤；利用预处理液对固定有祀DNA的固相支持物表面进行预处理；
[0010] B)前处理步骤；利用前处理液对所述固相支持物表面进行前处理；
[0011] C) 一步反应步骤：将所述祀DNA在包含碱性磯酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与 至少一种生物素标记的DM探针进行一步反应；
[0012] D)后处理步骤；步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述固相支持物表面进行 后处理；
[0013]巧显色反应步骤：将所述固相支持物置于底物溶液中进行显色反应。
[0014] 本发明的方法在步骤C)中直接将碱性磯酸酶标记链霉亲和素加入到杂交液中， 革己DNA与生物素标记的DNA探针在固相支持物表面进行分子杂交的过程中，同步实现了 碱性磯酸酶标记链霉亲和素与生物素结合的过程，从而将碱性磯酸酶偶联到DNA双链分子 上，使得祀DNA与生物素标记DNA探针可W在固相支持物表面直接形成碱性磯酸酶标记核 酸偶联物，省去了现有分子杂交技术中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤，不仅 提高了样品中祀DNA的检测效率，而且提高了固相支持物表面DNA分子杂交的特异性，有效 避免了检测结果的假阳性。
[0015] 根据本发明的一个具体实施例，步骤C)中所述碱性磯酸酶标记链霉亲和素在杂 交液中的浓度为5ng/ml~50ng/ml，优选为lOng/ml~40ng/ml，更优选为15ng/ml~30ng/ ml。
[0016] 本发明的方法将碱性磯酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，所述碱性磯酸 酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发明需要考虑的重要方面。本发明的发明人通 过大量实验与创造性劳动发现，碱性磯酸酶标记链霉亲和素的浓度过低，影响祀DNA检测 的灵敏度；碱性磯酸酶标记链霉亲和素的浓度过高，容易带来非特异性吸附现象，影响革己 DNA检测结果的准确性。可W列举的用于本发明的所述碱性磯酸酶标记链霉亲和素在杂交 液中的浓度的实例包括但不限于；5ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、 20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ m、30ng/ml或 50ng/ml。
[0017] 根据本发明的一个具体实施例，步骤C)中所述生物素标记的DNA探针在杂交液中 的浓度为0.Ipmol/ml~5pmol/ml,优选为0.化mol/ml~化mol/ml,更优选为0. 25pmol/ ml~Ipmol/ml。
[0018] 在本发明的方法中，本发明的发明人通过大量试验与创造性劳动发现，可W列 举的用于本发明的所述生物素标记DNA探针在杂交液中的浓度的实例包括但不限于： 0.lpmol/ml、0. 2pmol/ml、0. 3pmol/ml、0. 4pmol/ml、0. 5pmol/ml、0. 6pmol/ml、0. 7pmol/ml、 0. 8pmol/ml、0. 9pmol/ml、l. 0pmol/ml、2pmol/ml、3pmol/ml、4pmol/ml或 5pmol/ml。
[0019] 在本发明的方法中，所述碱性磯酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锋的金属 酶。每分子酶至少含2个化原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结合 位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚单 位的磯酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。
[0020] 在本发明的方法中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪哇丽环， 是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为喔吩环，C2上有一戊酸侧链；生物素分子通过 其末端的駿基与本发明所述的祀DNA连接，从而标记在祀DNA分子上。
[0021] 在本发明的方法中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4 条相同的肤链组成，每条肤链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个 生物素分子。此外，每条肤链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肤链中的色氨 酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数（κ)为10巧L/mol。在本发明的方法中，祀DNA与DNA探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进 行亲和结合，因此杂交液中的碱性磯酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的 DNA探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的祀DNA。
[0022] 根据本发明的一个具体实施例，步骤A)中所述预处理液包括封闭剂和非离子型 表面活性剂；其中，所述封闭剂为酪蛋白和/或牛血清白蛋白，所述非离子型表面活性剂为 吐温和/或曲拉通；在所述预处理液中，封闭剂占预处理液的1~5 % (w/v)，非离子型表面 活性剂占预处理液的0.05%~1% (v/v);优选地，封闭剂占预处理液的2~4% (w/v)，非 离子型表面活性剂占预处理液的0. 05 %~0. 2 % (v/v)。
[0023] 在本发明的方法中，所述封闭剂和非离子型表面活性剂的复配使用可W将固相 支持物表面能够与DNA相结合的活性位点进行封闭。所述吐温选自吐温20 (TWffiN-20)、 吐温 21aWEEN-21)、吐温 40 灯WEEN-40)、吐温 60 灯WEEN-60)、吐温 61aWEEN-61)、吐温 80灯WEEN-80)、吐温81aWEEN-81)和吐温85灯WEEN-85)，其中吐温20是特别优选的。 所述曲拉通选自曲拉通X-100灯ritonX-100)、曲拉通X-114灯ritonX-114)和曲拉通 X-200灯ritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特别优选的。
[0024] 根据本发明的一个具体实施例，骤A)中所述预处理液还包括阴离子型分散剂和 阴离子型聚丙帰醜胺；其中，所述阴离子型分散剂选自木质素礙酸盐，优选木质素礙酸钢； 在所述预处理液中，阴离子型分散剂占预处理液的0. 05 %~0. 2 % (w/v)，阴离子型聚丙 帰醜胺占预处理液的0. 02-0. 5% (w/v);优选地，阴离子型分散剂占预处理液的0. 1 %~ 0. 2% (w/v)，阴离子型聚丙帰醜胺占预处理液的0. 1-0. 3% (w/v)。
[00巧]在本发明的方法中，将固相支持物浸泡在预处理液中，在固相支持物表面形成了 固/液界面。在上述固/液界面上，一部分区域是固定在固相支持物表面的祀DNA与预处 理液形成的亲水界面，另一部分区域则是裸露的固相支持物表面直接与预处理液形成的疏 水界面，上述疏水界面在后续的杂交过程中可能会吸附生物素标记DNA探针、碱性磯酸酶 标记链霉亲和素或其他物质，带来干扰背景，影响检测结果的准确性。在本发明的方法中， 发明人通过在预处理液中加入的阴离子型分散剂和阴离子型聚丙帰醜胺与封闭剂和非离 子表面活性剂一起进行复配，有效提高了封闭剂和非离子表面活性剂在疏水界面的吸附效 果，极大地提高了检测结果的特异性。
[0026] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，所述阴离 子型分散剂可W对封闭剂产生足够的能垒，保证封闭剂在预处理液中分散更稳定。所述阴 离子型分散剂与封闭剂产生吸附作用，可W减少封闭剂因解聚结所需的机械功。将所述阴 离子型分散剂与非离子型表面活性剂进行复配，进一步提高了非离子表面活性剂的封闭效 果。所述阴离子型聚丙帰醜胺可W降低固/液界面的Stern电位，降低电能垒，促进分散在 预处理液中的封闭剂和非离子表面活性剂有效吸附到固相支持物的表面。由于聚丙帰醜胺 的亲水基在固相支持物表面能够优先定向吸附，疏水基指向水相，从而使固/液界面的张 力变大，固相支持物表面的拒水性增强，其结果是当封闭剂与固相支持物表面接触时，伸向 水相的疏水链相互作用的同时使封闭剂从预处理液中发生絮凝并有效吸附到固相支持物 的表面。
[0027]在本发明的一个优选实施例中，所述阴离子型分散剂优选为木质素礙酸钢 (SodiumLigninsulfonate)，其是一种天然高分子聚合物，具有很强的分散性，能吸附在固 体质点的表面上。因为其组织结构上存在各种活性基，因而能与封闭剂发生氨键作用。
[002引根据本发明