一种快速检测番茄灰霉菌的荧光定量pcr检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明为一种用于巧光定量PCR法检测番茄灰霉菌的试剂盒，专用于检测番茄灰 霉菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。
【背景技术】
[0002] 番茄灰霉菌度otrytiscinerea)，属于半知菌亚口的灰葡萄抱菌。灰霉病在我国 北方菜区是一种危害性很大的病害。塑料大棚、溫室、小拱棚等保护设施栽培的番茄、辣椒、 黄瓜、菜豆等蔬菜常发生灰霉病的流行，严重时减产达20-30%?上。我国南方菜区，过去较 少发生此病，但近年来由于保护设施栽培的发展，灰霉病也开始发生并有逐年加重的趋势。
[0003] 番茄灰霉病主要危害果实，也可W侵害叶片和茎等部位。果实受害一般先从残留 的花瓣、花托等处开始，出现湿润状，灰褐色不定形的病斑，逐渐发展成湿腐，从專片部向四 周发展，可使1/3W上的果实腐烂，病部长出一层鼠灰色茸毛状的霉层，此为病菌的分生抱 子梗和分生抱子。一般幼果发病较多，但即将转熟的大果也可受害，且常见整穗果实都发病 受害。叶片染病多从叶尖或叶缘开始，发生不定形的湿润状、灰褐色病斑，可造成叶片湿腐 调萎。茎部染病发生长楠圆形或不定形的长条状、灰褐色病斑，潮湿时亦长出灰色霉层，严 重的可引致病斑W上的茎、叶枯死。
[0004] 传统病原菌鉴定方法通常采用选择性培养基进行病原菌的分离培养，菌落形态观 察，显微镜下观察病菌的菌丝体，抱子等特征，结合田间发病植株症状的观察进行分类。传 统鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，具有很大局限性且费时费力。仅菌丝体和抱 子等的形态特征也即表型分析来鉴别，有时是不准确的。同一病原菌的菌落往往在形态上、 分布、生理性状等方面存在一定差异，难W进行准确鉴定。随着分子生物学技术的日益成熟 和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对±壤中病原 菌进行鉴定。分子生物学方法的简便、快速、高效、可靠等特点，是传统的分离培养方法所达 不到的。 阳0化]定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时巧光定量PCR技术（real-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)是一种在PCR反应体系中加 入巧光基团，利用巧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物烙解曲线分析可 W特异的检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技 术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反 应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研 究和医学研究等领域，但在农业植物病原真菌的定性定量检测研究中应用较少，尤其是在 番茄灰霉菌的定性定量研究中。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服番茄灰霉菌传统检测鉴定方法的不足，提供一种用于巧光 定量PCR法快速检测番茄灰霉菌的方法及其试剂盒。该方法采用根据番茄灰霉菌CNDll基 因所设计的特异性引物，优化巧光定量PCR反应体系，实现对发病植物组织中及果实中的 番茄灰霉菌的快速检测定量，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可W试剂盒的形式在 植物病害诊断与防治领域大规模推广。
[0007] 一种PCR快速检测番茄灰霉菌的方法，W番茄灰霉菌DNA为模板进行PCR反应，其 特征在于，所述PCR反应体系中加入有一对特异性引物CND11F/CND11R，该特异性引物的序 列分别为：
[0008] 特异性引物CND11F:5' -AACCCGACTTTGGACCTG-3，，
[0009] 特异性引物CND11R:5' -TTGCTTCCGATTGATTGC-3,。
[0010] 所述PCR反应体系终体积为20μ^其中10XPCRbuffer2μ^0. 5μΙ浓度为 15mM的MgCl2，1.6μL浓度为2.5mM的dNTPs，5μM的引物各0.5μL，5U/μLTaq酶0.2μL， DM模板1μ^灭菌双蒸水13. 7μ^PCR反应扩增程序为：94°C预变性3min;94°C变性 Imin，56°C退火Imin，72°C延伸Imin，共30个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0011] 所述PCR快速检测为实时巧光定量PCR检测。
[0012] 所述PCR反应体系中加入有SYBRGreenSupermix。 阳01引 所述PCR反应体系总体积为20yL，SYBRGreenSupermix10yL，lμL浓度为 10μΜ的特异性引物CNDllF，1μL浓度为10μΜ的特异性引物CND11R，DNA模板1μL，余量 为无菌双蒸水7μL巧光定量PCR反应程序：
[0014] 第 1 步：95. 0°C3 分钟，
[0015] 第 2 步：95. 0°C10 秒钟，
[0016] 第 3 步：59. 0°C30 秒钟，
[0017] 第4步：进行第2步程序，重复39次循环， 阳01引第5步：烙解曲线65. 0°C至95. 0°C，每5秒钟增加0. 5°C，
[0019] 第6步：结束。
[0020] 所述番茄灰霉菌DNA来自植物组织或果实。
[0021] 一种检测番茄灰霉菌的试剂盒，包括一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有特 异性引物CND11F/CND11R，该特异性引物的序列分别为：
[0022] 特异性引物CND11F:5' -AACCCGACTTTGGACCTG-3,，
[0023] 特异性引物CND11R:5' -TTGCTTCCGATTGATTGC-3,。
[0024] 所述PCR反应体系还包括巧光基团SYBRGreenSupermix。
[00巧]所述PCR反应体系为：SYBRGreenSupermix10μL，1μL浓度为10μΜ的特异性 引物CNDllF，1μL浓度为10μΜ的特异性引物CNDllR，无菌双蒸水7μL;反应时需加入的 待测番茄灰霉菌DNA模板为1μL。 阳0%] 本发明根据番茄灰霉菌CND11基因所设计的特异性引物CND11F/CND11R，可W特 异性扩增得到扩增出149bp的产物。同时本发明优化巧光定量PCR反应体系，实现对发病植 物组织中及果实中的番茄灰霉菌的快速检测定量，提高了检测的准确性，节约了检测时间， 可W试剂盒的形式在植物病害诊断与防治领域大规模推广。
[0027] 本发明的巧光定量PCR法检测番茄灰霉菌的试剂盒，可对植物组织及果实中的番 茄灰霉菌进行快速检测定量。与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0028] 检测准确性高，特异性好，可从植物组织和果实中准确地检测到番茄灰霉菌。
[0029] 检测灵敏度高，可检测番茄灰霉菌DNA浓度低至0.化g/mU对番茄灰霉菌的精确 检测可达到47个抱子。
[0030] 操作简便快捷，基于对核巧酸的检测，不受培养条件限制。定量检测，能真实反映 番茄灰霉菌定殖和侵染的情况；可同时进行高通量的样本检测。本发明提供的试剂盒可对 番茄灰霉菌进行快速定量检测，可W替代一直沿用的分离培养的传统鉴定方法，并适于在 植物病害诊断及防治领域广泛推广应用。
[0031] 因此本发明提供一种巧光定量PCR法检测番茄灰霉菌的试剂盒，实用性强，可满 足植物病害诊断及监测的需要。
【附图说明】
[0032] 图1为特异性检测引物对CND11F/CND11R对番茄灰霉菌及其近缘种、属真菌的PCR 扩增结果， 阳03引其中1-9号为引物对CND11F/CND11R扩增14种病原菌结果：M:lOObpMarker1.无DNA对照2.番茄灰霉菌度otiytiscinerea)3.禾谷镶刀 菌（Fusariumgraminearum)4.大丽轮枝菌（VerticiIliumdahliae)5.辣椒疫 霉（Phyto地thoracapsici)6.棉疫霉（Phyto地thoraboehmeriae)?.瓜果腐 霉（P}fthiumaphanide;rmatum)8.立枯丝核菌（Miizoctoniasolani)9.茄链格抱 (Alternariasolani)10.黑白轮枝菌（Ve;rticilliuma化 〇-at;rum)ll.尖抱镶刀菌 (Fusariumoxysporum) 12.腐皮镶刀菌（Fusariumsolani) 13.炭痘菌（Colletotrichum gloeosporioides) 14.群结腐霉（Pythiummyriotylum)；
[0034] 图2为番茄灰霉菌特异引物CNDllF/CNDllR的灵敏度检测结果，
[0035] 其中2-6号为番茄灰霉菌DNA模板浓度从高至低系列稀释（3化g/ni-O. 003ng/mL) M:100bpMarker1.无DM模板对照；
[0036] 图3为标准样品和未知样品的番茄灰霉菌巧光定量PCR扩增曲线图， 阳037] 其中y轴：巧光吸收率；X轴：循环数；
[0038] 图4为标准样品和未知样品的番茄灰霉菌巧光定量PCR烙解曲线图，
[0039] 图示烙解溫度为86°C; W40] 图5为柄;准样品和未知样品的番茄灰霉困欠光定量PCR柄;准曲线图，
[0041] 未知样品：1.上部病叶（有明显症状，3. 14X107个抱子），2.中部病叶（有明显 症状，2. 76X106个抱子），3.下部病叶（有症状，9. 56X104个抱子），4.红色病果（轻微症 状，6. 83X102个抱子），5.青色病果（轻微症状，47个抱子）。
【具体实施方式】
[0042] 下面所用各种试剂为市售产品，所用生物材料均为公开材料，本实验室均有保存， 可W对外公开发放。
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