一种鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列、核酸分子引物、试剂盒和方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于利用分子生物学方法鉴别食用菌真伪技术领域，具体设及一种鉴别白 玉茹的特征性核巧酸序列、核酸分子引物、试剂盒和方法。
【背景技术】：
[0002] 白玉茹（whiteHypsizigusmarmoreus)又名白色斑玉葦、白色真姬茹、白色蟹味 茹，在日本则称之为御茹或者称为御茸，是斑玉葦（真姬茹）（Hypsizygusmarmoreus)的白 色品系。白玉茹的茹体洁白如玉，质地细腻，口感特佳，其多糖、总黄酬、SOD等活性成分含量 均高于真姬茹，倍受国内外市场青睐，是食用菌中的"金枝玉叶"和上乘山珍佳品。因此，白 玉茹产业发展较快，日产量已达到鲜茹200吨W上，成为我国工厂化生产的主要品种之一。 因此，建立快速鉴别白玉茹的方法非常重要。
[0003] 目前，对白玉茹的鉴别需要将白玉茹菌种接种于培养基中形成菌丝体并培育成 子实体后，再利用子实体的形态特征进行鉴别，即目前白玉茹和真姬茹在菌丝体阶段时无 法从根据形态特征进行区分，它们的不同之处是白玉茹子实体通体白色而真姬茹则呈深褐 色。显然，利用形态特征鉴别的方法从菌丝体到子实体所需时间至少需要85天，鉴别时间 相当长。现有的研究主要集中于：利用不同菌株的括抗性及部分同工酶、ITSrDNA、RAPD、 SRAP和mtDNA技术对真姬茹和白玉茹的种内聚类分析和鉴定研究。然而括抗性和同工酶 技术操作复杂耗时长，白玉茹与真姬茹的口SrDNA序列一致，难于通过ITS序列鉴定，而 RFLP、RAPD、SRAP等因不能很好地与目标性状连锁而应用受到限制，mtDNA则存在遗传稳定 性的问题，因此，白玉茹的快速鉴别难于实现（张永杰，2015 ;牛脸东，2001)。W目标起始密 码子多态性（startcodontargetedpolymo巧hism，SCoT)分子标记是一种基于翻译起始 位点的目的基因分子标记新技术，依据基因中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计 单引物并对基因组进行扩增。具有重复性好，引物设计简单，可W在物种间通用的特点，能 有效产生和性状连锁的标记，可用于分子标记辅助育种、遗传多样性分析、Q化定位和集群 分离分析等诸多领域研究（CollardBCΥ，2009)。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供一种利用分子生物学手段，从遗传本质上鉴别白玉 茹，尤其是提供针对白玉茹菌丝体及其他白玉茹相关制品真假的鉴别白玉茹的特征性核巧 酸序列。
[0005] 本发明用于鉴别白玉茹的特征性核巧酸序列来源于目标起始密码子多态性 (SCoT)分子标记中的31号引物（即序列为5' -CCATGGCTACCACCGCCT-3'的非特异性引物）， 扩增白玉茹的基因组DNA，得到的立条基因片段，再经克隆、测序，并筛选特异性分子片段的 序列。所述的鉴别白玉茹的特征性核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。 阳006] 本发明的第二个目的是提供W白玉茹的特征性核巧酸序列（SEQIDNO. 1)为基础 的，设计用于鉴别白玉茹的核酸分子引物，该核酸分子引物序列如下：
[0007]FCHS:5'-GCGTGAAAGGTAGGAAGC-3'；
[0008] RCHS:5 --GGAGCACCGAGGGTTAGT-3 -。
[0009] 上述核酸分子引物序列FC服和RC服，它们的退火溫度相近（53°C~54°C)，GC含 量相当（55%~62%)，均不能形成引物二聚体，具有极高的专一性，仅能与白玉茹发生反 应，而不与真姬茹或其他食用菌扩增生成PCR条带。因此，利用该核酸分子引物通过PCR扩 增可W快速的对白玉茹（菌丝体、子实体）进行鉴别。
[0010] 本发明的第Ξ个目的是提供一种白玉茹快速鉴定试剂盒，包括上述的白玉茹的核 酸分子引物FC服、RC服和PCR反应试剂。
[0011] 所述的白玉茹快速鉴定试剂盒优选还包括真姬茹子实体DNA或真姬茹菌丝体 DNA，该DNA可W作为鉴定白玉茹的阴性对照，W及白玉茹菌丝体DNA或白玉茹子实体DNA， 该DNA可W作为鉴定白玉茹的阳性对照。
[0012] 本发明的第四个目的是提供一种鉴别白玉茹的方法，其特征在于，采用上述核酸 分子引物FC服和RC服作为扩增引物，W待测样品基因组DNA为模板，利用PCR的方法鉴定 待测样品是否是白玉茹。具体是经PCR扩增，电泳检测，可W直接获得清晰的白玉茹特异 性条带，无需测序步骤，实现对白玉茹菌丝体无需培养成子实体，直接鉴别其品种的快速鉴 别。
[0013] 优选，利用真姬茹菌丝体DNA或真姬茹子实体DNA作为PCR模板，W白玉茹的核酸 分子引物FC服和RC服作为PCR引物，进行常规的PCR，W作为阴性对照（如图3)。
[0014] 本发明基于SCoT分子标记中第31号引物扩增白玉茹基因组DNA，经克隆测序，获 得白玉茹的特征性核巧酸序列，该特征性核巧酸序列如SEQIDNO. 1，并根据该序列设计特 异性的核酸分子引物FC服和RC服。用该核酸分子引物，W白玉茹基因组DNA为模板，按照 常规PCR方法进行扩增，获得的DNA片段，经测序其具体序列为序列SEQIDNO. 1中第27~ 476位碱基所示，长度为45化P(如图1)。利用本发明的核酸分子引物FC服和RC服进行PCR 扩增，仅有白玉茹能够扩增获得该特异性片段，而其他样品没有扩增到任何片段（如图3)， 而利用真姬茹DNA作为PCR模板，W白玉茹的核酸分子引物FC服和RC服作为PCR引物，进 行常规的PCR，作为阴性对照（如图3)。本发明的核酸分子引物FC服和RC服具有极高的 专一性，可W用于快速的鉴别白玉茹（菌丝体和子实体）及其相关制品的真伪。
[0015] 本发明采用PCR技术进行检测，材料用量少，仅20mg就足够，方法简单，特异性好， 用时短，3h内即可完成。
【附图说明】：
[0016] 图1是本发明所述的鉴别白玉茹的特征性核巧酸序列，左侧为5'端，右侧为3' 端，其中黑色部分为核酸分子引物FC服和RC服扩增的片段大小及位置。 阳017] 图2是利用SCoT分子标记中第31号引物作为PCR引物按照常规的PCR方法对不 同样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、白玉茹菌丝体DNA，2、白玉茹子实体DNA，3、真姬 茹菌丝体DNA，4、真姬茹子实体DNA，Μ为2肺的DNA分子量标准，从上到下分别是2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。
[0018] 图3是利用白玉茹的核酸分子引物FC服和RC服作为PCR引物按照常规的PCR方 法对不同样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、白玉茹菌