一种检测禽流感病毒及其h3、n2亚型的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测禽流感病毒及其册、N2亚型的引物及其应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 禽流感（Avianinfluenza,AI)是危害禽类养殖的一类重要传染病，其病原体AIV 为单股负链的RNA病毒，分8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白。在 AIV8个基因片段中，Μ基因是最保守的基因片段，所有亚型AIV的PCR检测均选择Μ基因 作为祀基因。ΗΑ、ΝΑ是变异最大的两个基因节段，两者之间存在的某种平衡对病毒的致病 性有很大关系。根据ΗΑ、ΝΑ基因抗原性差异，AIV可进一步分为不同的亚型，目前已鉴别 出18种ΗΜΗ1-Η18)亚型和11种NA(Nl-Nll)亚型。册亚型AIV属于低致病性AIV，其在 低致病性AIV中占有较重要地位。研究表明，册亚型AIV在家禽中分离率较高，且在不同 家禽中分布的季节性与我国人群中流感病毒流行的季节性比较一致，送就为两种宿主的流 感病毒在猪送个"混合器"中发生基因重排提供了条件。1968年暴发的香港流感病毒A/ 化叫Kong/68化3N2)经研究推测就是由册亚型AIV与肥N2亚型人流感病毒在宿主猪体内 发生基因重排而产生的。此外，肥亚型AIV是感染家禽（H9N2)并能致病的常见NA亚型， 其可与大多数HA亚型AIV组合形成不同血清型的AIV。因此，建立一种简便、快速检测AIV 且能同时鉴别H3N2亚型AIV的方法对我国养禽业和公共卫生都有重要意义。
[0003] 长期W来，针对AIV的检测主要依靠传统的病原分离鉴定与血清学试验，送些方 法耗时较长，给诊断带来了一定的局限性。随着分子生物学和生物试剂的不断发展，PCR检 测方法已成为病毒检测的重要部分。而多重RT-PCRW其同一反应中可同时扩增出多个核 巧酸片段的优势已应用于多项病毒和基因的同时检测。而目前专口针对H3N2亚型AIV的 PCR检测方法未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测禽流感病毒及其H3、N2亚型的引物及其应用。
[000引本发明提供一组引物，由如下（1)-(6)所示的DNA分子组成：
[0006] (1)沈QIDNo. 1 所示的 DNA 分子；
[0007] (2)沈QIDNo. 2 所示的 DNA 分子；
[0008] (3)沈QIDNo. 3 所示的 DNA 分子；
[0009] (4)沈QIDNo. 4 所示的 DNA 分子；
[0010] (5)沈QIDNo. 5 所示的 DNA 分子；
[0011] (6)沈QIDNo.6所示的 DNA 分子。
[0012] 一种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中册亚型和/或N2亚型 禽流感病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述引物。
[0013] 一种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中册亚型和/或N2亚型 禽流感病毒的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤；W待测样品的cDNA为模板，W上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物含有大小为518bp 的条带，则待测样品候选为含有禽流感病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别 为518bp和27化P的条带，则待测样品候选为含有H3亚型禽流感病毒的样品；如果PCR扩 增产物同时含有大小分别为518bp和418bp的条带，则待测样品候选为含有N2亚型禽流感 病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别为518bp、418bp和271bp的条带，则待测 样品候选为含有H3N2亚型禽流感病毒的样品；
[0014] 所述大小为518bp的条带是W沈QIDNo. 5和沈QIDNo.6所示的DNA分子为引 物进行PCR扩增得到的；
[0015] 所述大小为418bp的条带是W沈QIDNo. 3和沈QIDNo. 4所示的DNA分子为引 物进行PCR扩增得到的；
[0016] 所述大小为27化P的条带是W沈QIDNo. 1和沈QIDNo. 2所示的DNA分子为引 物进行PCR扩增得到的。
[0017] 上述方法中，所述PCR的反应体系如下；2XPCR扩增缓冲液12.加L，浓度为 25pmol/uL的沈QIDNo. 1所示的DNA分子、沈QIDNo. 2所示的DNA分子、沈QIDNo. 3 所示的DM分子、SEQIDNo. 4所示的DM分子、SEQIDNo. 5所示的DM分子和SEQID No. 6所示的DNA分子均为0.加L，模板cDNA化L，加d地2〇补足体系至25uL;
[001引 所述2XPCR扩增缓冲液的商品名称为2XTaqPCRMasterMIX,购自Invitrogen 公司，产品目录号为PT102。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述PCR的反应程序如下；94°C4min;94°C45s，55°C 45s，72°Clmin，35个循环；72°C延伸lOmin，最后4°C结束反应。
[0020] 上述引物在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H3亚型和 /或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0021] 上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H3亚型 和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0022] 上述任一所述的应用中，所述禽流感病毒为如下任一亚型出3N8、H9N2、册N2、 H1N2、册N6、H4N2、册肥、册肥、H7N2。
[0023] 本发明根据AIV最保守的Μ基因和册、N2亚型AIVHA、NA基因保守区域分别设 计了 3对特异性引物，建立了可W检测AIV且能同时进行册、Ν2亚型AIV分型检测的Η重 RT-PCR。特异性结果显示，该Η重RT-PCR对册Ν2亚型AIV可同时扩增出3条特异性条带， 分别为518bp的Μ基因条带、418bp的ΝΑ基因条带、27化Ρ的ΗΑ基因条带；非肥亚型的册 亚型AIV和非册亚型的N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带，分别为518bp、27化P和 518bp、418bp;其它亚型AIV只能扩增出一条大小为518bp的Μ基因条带，而常见禽病病原 体均未扩增出任何条带，表明本研究设计的Η重RT-PCR具有较好的特异性。敏感性结果表 明，该Η重RT-PCR最低能检测到10化g的册Ν2亚型AIVcDNA。临床样品检测结果与病毒 分离鉴定结果一致，证明了该方法的有效实用性。
[0024] 因此，本发明建立的Η重RT-PCR是一种简便、快速、有效的检测AIV且能同时进行 H3、N2亚型AIV分型检测的技术，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[002引 图1为Η重RT-PCR扩增结果。
[0026] 图2为特异性检测结果。
[0027] 图3为敏感性检测结果。
[002引图4为临床样品检测结果。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 2XTaqPCRMasterMIX购自Invitrogen公司，产品目录号为ΡΤ102。
[0032] DNA/RNA抽提试剂盒购自TaKaRa公司，产品目录号为9766。
[0033] A/Goose/Guangxi/020G/2009〇13N8)在文献"LiuT，XieZSongD，et al.GeneticCharacterizationofaNatural民eassortantH3N8AvianInfluenza VirusIsolatedfromDomesticGeeseinGuangxi,SouthernChina.Genome Announc. 2014, 2(4) :e00747-14."中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0034] A/turtledove/加angxi/49B6/2〇l3(H9N2)在文献"XuQ，XieZ，XieLet al.CharacterizationofanavaininfluenzavirusH9N2strainisolatedfroma wildbirdinsou化ernQiina.GenomeAnnounc. 2014,2:e00600-14·"中公开过，公众可从 广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0035] A/Duck/Guangxi/M2/2009〇13N2)在文献。化ngYl，XieZ,LiuJ，etal.Visual detectionofH3subtypeavianinfluenzavirusesbyreversetranscription loop-mediatedisothermalamplificationassay.VirologyJournal, 2011，8:337. '，中公 开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0036] A/Duck/加angxi/N42/2009化3N2)、A/Duck/加angxi/M20/2009化3N2)在文 献"PengY,XieZ,LiuJ,etal.VisualdetectionofH3subtypeavianinfluenza virusesbyreversetranscriptionloop-mediatedisothermalampli円cationassay. VirolJ，2011，8:337."中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0037] A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)在文献"彭宜，谢芝励，郭捷，等.利 用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型"，病毒学 报，2013, 29 (2) : 154-1