人广泛自我更新型成红细胞(esre)的制作方法
【专利说明】人广泛自我更新型成红细胞（ESRE)
[0001 ] 关于联邦赞助研究或开发的声明
[0002] 本发明在国立卫生研究院（NIH)颁发的UOl HL099656下借助政府资助进行。政 府具有本专利的某些权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2014年5月15日提交的美国临时申请序列号61/823, 677的优先权， 其通过引用整体并入本文。
[0005] 发明背景
[0006] 在美国每年输注超过1600万个单位的红血细胞（RBC)以满足外伤、手术或癌症化 疗后危重患者的临床需要。目前，输注用RBC的供给仅仅依赖于捐赠者，这尤其是对于稀有 血型而言，伴有感染风险、高筛选成本和供给瓶颈。在接下来的几十年，对红细胞输注的需 要将随着美国人口老龄化而增加。因此，需要用于输血的替代来源。
[0007] 使用基于胚胎干（ES)细胞的方法生成红细胞受可量测性和有限的生成红细胞祖 细胞的方法限制。虽然先前技术已经使用了骨髓源性和脐血源性造血干细胞，但尚未实现 红系祖细胞的可用产生。相反，存在用于红系祖细胞终末分化和去核的技术，然而，"起始细 胞"的大量产生尚未成功（Giarratana，2011)。本发明解决了本领域中这种未满足的需要。 发明概要
[0008] 本发明提供了一种在培养中增殖并且保持最终成熟的能力的人广泛自我更新型 成红细胞（ESRE)分离群，其中ESRE未永生化。
[0009] 在一个实施方案中，ESRE群能够经历至少30次细胞分裂。
[0010] 在一个实施方案中，ESRE群源自定形红系祖细胞群，进一步地其中ESRE群与经历 限制性自我更新的成红细胞和原代原成红细胞相比表现出更高的Bmi-I表达水平。
[0011] 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以表达一种或多种治疗性蛋白。
[0012] 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以表达选自因子IX、因子VIIIc、温韦伯氏因 子（von Willebrand' s factor)、组织型纤溶酶原活化物、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III及 其任何组合的因子。
[0013] 本发明还提供了一种组合物，其包含人ESRE分离群及包含Epo、SCF、地塞米松和 脂质混合物的扩增培养基。
[0014] 在一个实施方案中，扩增培养基还包含Bmi-I蛋白、Bmi-I肽和Bmi-I调节剂中的 一种或多种。
[0015] 本发明还提供了一种源自ESRE群的人RBC分离群。
[0016] 本发明还提供了一种由人细胞生成基本上纯的ESRE群的方法。在一个实施方案 中，该方法包括a)在促进分化细胞群生成的条件下培养人细胞，b)使分化细胞群在包含 Epo、SCF、地塞米松和脂质混合物的扩增培养基中扩增，从而生成基本上纯的ESRE群。
[0017] 在一个实施方案中，人细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干（iPS)细胞、成体干细 胞、脐血细胞、骨髓细胞及其组合。
[0018] 在一个实施方案中，步骤a)中的分化细胞群源自类胚体（EB)。
[0019] 在一个实施方案中，在步骤a)中，细胞经培养以产生定形红系祖细胞群。
[0020] 在一个实施方案中，细胞在步骤a)中培养至少约20天。
[0021] 在一个实施方案中，在步骤b)中，ESRE群连续经历自我更新细胞分裂至少约45 天。
[0022] 在一个实施方案中，在步骤b)中，按足以调节红系细胞自我更新的量向分化细胞 群提供Bmi-I蛋白、Bmi-I肽和Bmi-I调节剂中的一种或多种。
[0023] 在一个实施方案中，Bmi-I调节剂为刺猬因子配体。
[0024] 在一个实施方案中，扩增培养基为补充了 2U/mL Epo、约lOOng/mL人重组SCF、约 10 6M地塞米松、约40ng/mL人重组胰岛素样生长因子-1和约0. 4%脂质混合物的无动物组 分培养基。
[0025] 本发明还提供了一种向哺乳动物递送基因的方法。在一个实施方案中，该方法包 括向哺乳动物施用基因递送媒介物，其中媒介物包含经遗传修饰的ESRE。
[0026] 本发明还提供了一种生成人红血细胞（RBC)的方法。在一个实施方案中，该方法 包括在包含EPO和胰岛素的分化培养基中培养ESRE。
[0027] 本发明还提供了一种治疗有RBC输注需要的受试者的方法。在一个实施方案中， 该方法包括向受试者施用源自ESRE群的人RBC分离群。
[0028] 在一个实施方案中，RBC由从受试者获得的细胞生成。
[0029] 在一个实施方案中，从受试者获得的细胞选自胚胎干细胞、iPS细胞、成体干细胞、 脐血细胞、骨髓细胞及其任何组合。
[0030] 本发明还提供了一种治疗患有血液病的受试者的方法。在一个实施方案中，该方 法包括向受试者引入治疗有效量的ESRE。
[0031] 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以表达一种或多种因子以便治疗患有血液病 的受试者。
[0032] 在一个实施方案中，血液病为血友病。
[0033] 在一个实施方案中，因子选自因子VIII或因子Villa、因子V、因子Va、因子IX、因 子X、因子XI、因子XII、因子XIII、温韦伯氏因子、组织型纤溶酶原活化物、蛋白C、蛋白S、 抗凝血酶III及其任何组合。
[0034] 本发明还提供了一种筛选调节ESRE基因表达的测试化合物的方法。在一个实施 方案中，该方法包括使ESRE与测试化合物接触并且当测试化合物存在时的基因表达水平 不同于测试化合物不存在时的基因表达水平时，将该化合物鉴定为ESRE基因表达的调节 剂。
[0035] 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以包含编码与珠蛋白基因启动子可操作性连 接的可检测多肽的核酸序列。
[0036] 在一个实施方案中，珠蛋白基因启动子选自人γ-珠蛋白基因启动子和人β-珠 蛋白基因启动子。
[0037] 在一个实施方案中，可检测多肽选自荧光素酶、荧光蛋白、红色荧光蛋白、磷酸酶、 过氧化物酶、激酶、氯霉素转移酶和半乳糖苷酶。
[0038] 在一个实施方案中，该方法包括测量在测试化合物存在和不存在时的可检测多肽 水平，其中与测试化合物不存在时的可检测多肽水平相比，测试化合物存在时的可检测多 肽水平增加将该测试化合物鉴定为活化珠蛋白基因启动子的化合物。
[0039] 在一个实施方案中，该方法包括测量在测试化合物存在和不存在时的可检测多肽 水平，其中与测试化合物不存在时的可检测多肽水平相比，测试化合物存在时的可检测多 肽水平降低将该测试化合物鉴定为抑制珠蛋白基因表达的化合物。
[0040] 在一个实施方案中，测试化合物选自小分子、核酸分子、多肽、合成化合物和天然 存在的化合物。
[0041] 附图简述
[0042] 连同附图一起阅读时会更好地理解以下对本发明优选实施方案的详细描述。为了 说明本发明的目的，在图中示出了目前优选的实施方案。然而，应理解，本发明不限于图中 所示实施方案的精确布置和手段。
[0043] 图1，包括图IA和1B，为显示哺乳动物红细胞生成的一系列图像。（图1A)体内 稳态红细胞生成的特征在于去核形成网织红细胞（网状细胞）的红系定向祖细胞（BFU-E、 CFU-E)和红系前体细胞（ProE、BasoE、PolyE和OrthoE)的有限扩增。（图1B)脐血和成体 骨髓的离体培养产生自我更新能力有限的成红细胞。
[0044] 图2,包括图2A和2B，为显示鼠广泛自我更新型成红细胞（ESRE)的一系列图像。 (图2A)来自于成体骨髓的成红细胞培养物展示出有限的自我更新。相反，来自于E9. 5小 鼠卵黄囊和E14. 5肝脏的成红细胞培养物经历广泛自我更新。（图2B)增殖成红细胞表达 出高水平的c-Kit并且具有原成红细胞形态。分化后，TER119表达增加并且细胞成熟为网 织红细胞。
[0045] 图3为显示IV注射了来自于小鼠骨髓（LSK)的未成熟骨髓造血祖细胞或源自 UBC-GFP小鼠的ESRE的NSG小鼠中网织红细胞和成熟RBC的循环的图像。体内分化后，ESRE 产生在尺寸和形态上与野生型RBC相似的一波瞬态GFP+RBC(右图）。
[0046] 图4,包括图4A至41，为显示人H1ES/EB中红系细胞潜能的出现的一系列图像。 (图4A)从人EB出现红系祖细胞的两个连续波。（图4B)红系集落的形态（上）和细胞 组成（下）展现出与原始和定形红系细胞特性一致的形态。（图4C)来自于第11-19天 EB(EBD11、EBD19)的5个红系集落的基因表达分析。来自于第11天至第16天EB的红系 集落主要表达胚胎珠蛋白基因（上图），但不表达糖皮质激素受体（GR，Nr3cl基因；下 图）。相反，来自于第17天和第19天EB的红系集落主要表达胎儿γ-珠蛋白基因（上图） 以及GR(下图）。（图4D)上图：源自体外分化19天的Hl人ES细胞的自我更新型人成红 细胞。下图：在EPO和胰岛素中分化的人成红细胞在体外成熟为网织红细胞。（图4E)人 ESC作为类胚体（EB)无血清分化成血细胞命运的方案。图4F至4H为人定形自我更新型成 红细胞的图像。（图4F)人自我更新型成红细胞（SR)表达红系细胞特异性标记物⑶235a 并且含有大核（DAPI)。这些细胞的体外分化（Diff)产生缺乏DNA的小RBC。（图4G)自 我更新型（SR)和分化的（Diff)hESC源性红系细胞表达的β样珠蛋白mRNA的相对水平。 人成红细胞成熟与珠蛋白从胎儿γ -珠蛋白"转化"为成体β -珠蛋白相关。（图4H)小鼠 ESRE(GFP标记的）能够在体内完全成熟并且作为RBC在体内循环几周。（图41)描绘了成 红细胞（在扩增第36天）的增殖形态。
[0047] 图5,包括图5A至5C，为展示在有限对比广泛红系细胞自我更新中的p53生物学 的一系列图像。（图5A)经历有限或广泛自我更新的成红细胞对丝裂霉素 C的应答。（图 5B)暴露于0.1 uM丝裂霉素 C的非凋亡和凋亡性自我更新型成红细胞的流式细胞术的图像。 凋亡细胞具有核起泡现象。（图5C)经丝裂霉素 C或媒介物处理的成红细胞中p53应答基 因的表达（qPCR)。ESRE不表达凋亡效应子PERP。nd=未检测。
[0048] 图6为描绘p53蛋白的免疫组织化学定位的图像。上图：经辐照的小鼠脾细胞中 的P53主要在细胞核中。中图：经历有限自我更新的成红细胞中的p53在细胞质和细胞核 中。下图：经历广泛自我更新的成红细胞中的P53主要在细胞质中。
[0049] 图7为展示过表达Bmi-I的人胎肝细胞持续增殖75天以上的图像。
[0050] 图8为描绘过表达Bmi-I的扩增的人胎肝细胞成熟为晚期成红细胞并且甚至去核 形成网织红细胞的图像。
[0051] 图9为显示来自于含有过表达Bmi-I的细胞的培养物的人成红细胞的实例的图 像。
[0052] 图10为显示从StemSpan扩增培养基中撤回脂质补充物放慢了成红细胞增殖的图 表。
[0053] 图11为显示从StemPr〇34扩增培养基中撤回脂质补充物阻止了经历有限自我更 新（SRE)的成红细胞进入"广泛"阶段和变成ESRE的能力的图表。
[0054] 图12为显示当ESRE用或不用脂质补充物培养5天时，与含有脂质的对照培养基 相比在"无脂质"条件下Bmil转录水平降低的图表。
[0055] 图13,包括图13A和13B，为显示诱导成年小鼠细胞中Bmi-I表达导致自我更新增 强的一系列图表。图13A显示Bmi-I过表达感染的成体骨髓细胞（源自野生型成年小鼠） 与空载体对照相比已经连续增殖至少两倍时长。图13B显示Bmi-I过表达感染的小鼠成体 骨髓细胞（源自蛋白4. 1敲除小鼠）与空载体对照相比已经连续增殖至少30天以上。 [0056] 图14为显示增殖细胞（蛋白4. 1敲除小鼠；扩增第16天；下图）具有未成熟成红 细胞的形态（吉姆萨染色（Giemsa staining))的图表。当置于红系细胞成熟培养基中3 天时，这些未成熟成红细胞成熟为晚期成红细胞并且甚至去核形成网织红细胞。这些数据 支持ESRE可用作研究红系细胞特有疾病的模型系统的观念。
[0057] 图15为显示诱导人成红细胞中Bmi-I表达导致其广泛自我更新的图表。
[0058] 图16,包括图16A至16C，为展示ESRE的生成的一系列示意图。图16A为生成ESRE 的两种方式的示意图，由此1)可由扩增定形胚胎造血祖细胞群得到ESRE或2) Bmil转导至 胎儿/成体造血祖细胞中并扩增这种细胞群。图16B为显示从人胚胎干细胞的多能状态到 无核红血细胞牵涉一系列不同的步骤的示意图。首先，人ESC向"定形红系祖细胞"分化。 当发现定形潜能时，再用EPO、SCF和DEX进一步培养那些红系细胞以诱导成红细胞的自我 更新。另外，这些自我更新型成红细胞保持其最终成熟的功能性能力。图16C为显示来自 于成体骨髓的定形红系祖细胞经Bmil过表达转导，然后具有Bmil过表达的那些红系细胞 继续用EP0、SCF和DEX培养以诱导成红细胞的广泛自我更新的示意图。另外，具有Bmil过 表达的这些自我更新型成红细胞保持其最终成熟的功能性能力。
[0059] 图17为显示为使经历广泛自我更新的潜能最大化对人培养条件的优化的图表。 第9天来自于类胚体（EB)的原始红系细胞不能在扩增培养基（StemSpan ;EP0、SCF、Dex、 IGFUExCyte)中自我更新。这些红系细胞经历最终红系细胞成熟而非自我更新细胞分裂。 在"StemSpan培养基"中源自第16或38天EB的定形成红细胞自我更新2-3周。在人源化 "StemSpan-ACF培养基"中源自第38天EB的定形成红细胞持续自我更新约5-6周。
[0060] 详述
[0061] 本发明涉及生成可广泛地自我更新并且仍保持分化为红血细胞（RBC)的能力的 人细胞群的发现。本文将这些细胞称为广泛自我更新型成红细胞（ESRE)。本发明的所述细 胞尤其用作RBC的可再生源。
[0062] 在一个实施方案中，使用导致定形红系祖细胞潜能出现的分化方案由分化干细胞 生成本发明的ESRE。在一个实施方案中，该方法包括在产生红系祖细胞潜能的条件下培养 干细胞，由此在体外生成ESRE。在一个实施方案中，通过将分化的干细胞置于扩增培养基内 生成ESRE。在一个实施方案中，扩增培养基包括补充了 Epo、SCF、地塞米松、胰岛素样生长 因子-1和脂质混合物的无血清培养基。在一个实施方案中，在本发明的扩增培养基中培养 分化的干细胞导致长出持续增殖而不分化的红系前体细胞，即它们经历自我更新分裂。在 一个实施方案中，这些自我更新型成红细胞不断持续自我更新至少45天。在一个实施方案 中，ESRE未永生化。然后本发明的ESRE可分化为RBC。在一个实施方案中，ESRE置于分化 培养基中导致其成熟为晚期成红细胞和网织红细胞。在一个实施方案中，ESRE在体内注射 时分化。
[0063] 在一个实施方案中，通过为细胞提供活化细胞内的Bmi-I的试剂来提高本发明的 ESRE的生成和维持。这是因为本发明部分基于发现Bmi-I是红系细胞自我更新的中心调节 因子。即，观察到与经历有限（SRE)自我更新的成红细胞以及多个原代原成红细胞（ProE) 群相比，ESRE表现出更高的Bmi-I表达水平。另外，观察到过表达Bmi-I的细胞持续增殖 75天以上。因此，在一个实施方案中，本发明包括一种调节红系细胞自我更新的方法。在一 个实施方案中，该方法包括按足以调节细胞的红系细胞自我更新的量为具有红系祖细胞潜 能的细胞提供Bmi-I或其变体或片段和/或Bmi-I调节剂；并且培养该细胞足以调节红系 细胞自我更新的时间。在一个实施方案中，调节细胞的红系细胞自我更新是对细胞扩增的 促进。
[0064] 在本发明的一个实施方案中，Bmi-I或其变体或片段和/或Bmi-I调节剂选自小 分子、脂质分子、糖及其复合物。
[0065] 在另一个实施方案中，Bmi-I调节剂包括但不限于脂质、脂蛋白、胆固醇、磷脂和脂 肪酸。在一个实施方案中，脂质、脂蛋白、胆固醇、磷脂和脂肪酸的混合物是可以补充到细胞 培养物中以调节红系细胞自我更新的脂质源。在一个实施方案中，Bmi-I调节剂为刺猬因 子配体。在另一个实施方案中，Bmi-I调节剂为25-羟基胆固醇。
[0066] 在一个实施方案中，Bmi-I的活化可用于由脐血细胞或骨髓细胞生成ESRE。
[0067] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种筛选调节红系细胞自我更新的试剂的方 法。该方法包括步骤：（i)提供该试剂的候选物质；（ii)将含有Bmi-I的细胞暴露于该物 质；及（iii)确定Bmi-I是否受调节，其中当Bmi-I受调节时，确定该物质为能够调节红系 细胞自我更新的试剂。
[0068] 本发明还包括ESRE的后代，包括在ESRE向红血细胞（RBC)分化期间生成的任何 细胞类型或表现出RBC的至少一种特征的细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种制备 ESRE和来自其的后代细胞的方法。在另一个实施方案中，本发明包括一种得到ESRE以及 ESRE后代的培养系统。在各个实施方案中，本发明包括一种使用ESRE和来自其的后代治疗 需要RBC的受试者的方法。在一个实施方案中，本发明的ESRE允许RBC产生。本发明的细 胞提供了无限的RBC来源。
[0069] 在一个实施方案中，本发明提供了用于由干细胞或等效细胞生成或产生更多数量 的红系祖细胞的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备RBC的新方法。 在另一个实施方案中，本发明教导了增加定向干细胞向红系谱系分化倾向的方法。
[0070] 在一个实施方案中，本发明提供了包含类胚体（EB)的细胞或干细胞（包括其后 代）的组合物、产品（制品）和/或分离物、混合物或培养物；足够量的生长因子；刺激红系 谱系定向的组合物或试剂或其等效物，以诱导形成（或分化为）ESRE。
[0071] 本发明提供了本发明的细胞的组合物、产品或分离物、混合物或培养物用于