流体装置的新用图
【技术领域】
[0001] 各实施方案总体上涉及流体装置，具体涉及此类流体装置用于测定微生物对测检 物的响应的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 抗生素抗性细菌日渐成为全球性问题，因为抗生素无法杀灭这些细菌或使其停止 分裂。细菌的传代时间在许多情况下可非常快（大约20分钟），并且由于细菌的短传代时 间和相对的遗传不稳定性，细菌可快速获得对抗生素的抗性。抗生素抗性细菌感染的患病 率在日益增加，这些细菌中的一些已经变得具有多重抗性，这有时意味着没有可用于终止 这些细菌生长的有效抗生素。这些多重抗性细菌是严重的公共卫生问题，因为感染此类细 菌的患者可由于其细菌感染无法被治疗而死亡。
[0004] 用于鉴定和研究微生物（包括但不限于细菌、真菌、寄生生物和病毒）及其对杀灭 微生物或抑制微生物生长的抗生素的抗性的传统方法在细菌实例中主要受限于Luria肉 汤（LB)琼脂平板。这些LB琼脂平板于是被制成包含限定浓度的杀菌和抑菌抗生素。针对 抗生素易感性测试（AST)和抗生素或其他测检物对微生物的效应评价的此类二维（2D)培 养法具有若干限制。例如，这些设置通常需要将微生物如细菌过夜培养以允许清楚的结果 读出，该结果读出显示特定的细菌菌株对给定的抗生素是否具有抗性。此外，通常每个LB 琼脂平板仅可测试单一抗生素浓度。
[0005] 另一种现有技术AST方法采用所谓的E试验。E试验基本上为琼脂扩散法并使用 浸渍有不同浓度的测检物的矩形条，所述测检物作为抗生素的效应有待评价。在典型的方 法中，在将E试验条置于琼脂平板的情况下，细菌在2D培养中在琼脂平板的顶部散布和生 长。E试验条通过扩散来释放测检物，并且在孵育24小时后检测释放的测检物的生长抑制 效应。除了很长的孵育时间之外，此方法的局限是仅可在数字步阶不同并且E试验条中使 用选定浓度的情况下读出测检物的抑制浓度。
[0006] 另一传统的AST方法使用微量滴定板测定，其中不同的孔内具有不同浓度的测检 物。通常将添加有细菌的微量滴定板孵育过夜，并且通过测量不同孔中的光学浊度来评价 对细菌的抑制效应。此方法的缺点与使用E试验条时的缺点基本上相同。
[0007] 为了缩短AST时间，已开发出用于快速AST (RAST)的微流体通道系统。此类RAST 方法包括液滴式微流体通道系统，在该液滴式微流体通道系统中，细菌被捕获在包含抗生 素的液滴中[1-3]。液滴式系统的局限是仅可测试单一抗生素浓度。其他RAST方法包括使 用气体可渗透聚二甲基硅氧烷（PDMS)微通道[4];将细菌介电电泳捕获在微流体电极结构 中[5-6];含有抗生素的预载PDMS层[7];使细菌共价结合到微流体通道并使它们经受机 械剪切应力[8];使用异步磁珠旋转（AMBR)生物传感器[9]或跟踪微流体琼脂糖通道系统 内的单细胞生长[10]，这些各种RAST方法的主要局限是它们仅可测试单一抗生素浓度或 一组少量的选定抗生素浓度。
[0008] 还进一步提议使用用于分析细菌生物膜抗生素易感性的微流体系统[11]，然而其 微流体系统需要24小时的孵育并且待测试细菌含有能够表达绿荧光蛋白（GFP)的质粒。
[0009] 因此，仍然需要不具有现有技术缺点的响应微生物检验的快速方法和系统。
[0010] 发明概述
[0011] 总体目标是允许有效快速地测定微生物对测检物的响应。
[0012] 此目标和其他目标通过本文所定义的实施方案来满足。
[0013] 实施方案的一个方面涉及一种测定微生物对测检物的响应的方法。所述方法包括 在三维（3D)培养基质中提供微生物的培养物，所述三维培养基质布置在流体装置的培养 室中，所述流体装置具有侧接所述培养室的第一末端部分的第一流体通道和侧接所述培养 室的第二不同末端部分的第二流体通道。所述方法还包括将第一流体通道的输入连接至包 含第一浓度的测检物的第一流体流。所述方法还包括将第二流体通道的输入连接至不含测 检物或包含第二浓度的测检物的第二流体流，所述第二浓度低于所述第一浓度，从而在3D 培养基质的至少一部分上形成测检物的浓度梯度。所述方法另外包括基于3D培养基质中 的任意边界区相对于第一末端部分和/或第二不同末端部分的位置来测定微生物对测检 物的响应。所述边界区在微生物显示出对测检物的第一响应的第一响应区与微生物显示出 对测检物的第二不同响应的第二响应区之间。
[0014] 实施方案的另一方面涉及一种用于测定微生物对测检物的响应的系统。所述系统 包括流体装置，所述流体装置包括培养室，所述培养室被构造成将微生物的培养物容纳在 3D培养基质中。所述流体装置还包括侧接所述培养室的第一末端部分的第一流体通道和 侧接所述培养室的第二不同末端部分的第二流体通道。所述系统还包括第一流体贮存器， 所述第一流体贮存器包含第一流体，所述第一流体包含第一浓度的测检物。所述第一流体 贮存器被构造成连接至所述第一流体通道的输入。所述系统还包括第二流体贮存器，所述 第二流体贮存器包含第二流体，所述第二流体不含测检物或包含低于第一浓度的第二浓度 的测检物。所述第二流体贮存器被构造成连接至所述第二流体通道的输入以在3D培养基 质的至少一部分上形成测检物的浓度梯度。所述系统另外包括基于计算机的系统，所述基 于计算机的系统被配置成获取3D培养基质的至少一个图像并对所述至少一个图像进行处 理以鉴定3D培养基质中的任意边界区相对于第一末端部分和/或第二不同末端部分的位 置。所述边界区在微生物显示出对测检物的第一响应的第一响应区与微生物显示出对测检 物的第二不同响应的第二响应区之间。所述基于计算机的系统还被配置成基于边界区的位 置来测定微生物对测检物的响应。
[0015] 实施方案的另一方面涉及流体装置用于测定微生物对测检物的响应的用途。所述 流体装置包括培养室，所述培养室被构造成将微生物的培养物容纳在3D培养基质中。所述 流体装置还包括第一流体通道，所述第一流体通道侧接所述培养室的第一末端部分并且被 构造成运载包含第一浓度的测检物的第一流体流。所述流体装置还包括第二流体通道，所 述第二流体通道侧接所述培养室的第二不同末端部分并且被构造成运载不含测检物或包 含第二浓度的测检物的第二流体流，所述第二浓度低于所述第一浓度，从而在3D培养基质 的至少一部分上形成测检物的浓度梯度。所述用途包括基于3D培养基质中的任意边界区 相对于第一末端部分和/或第二不同末端部分的位置来测定微生物对测检物的响应。所述 边界区在微生物显示出对测检物的第一响应的第一响应区与微生物显示出对测检物的第 二不同响应的第二响应区之间。
[0016] 实施方案的各方面允许快速有效地测定微生物对各种测检物的响应。可根据实施 方案测试微生物对连续范围的浓度的响应。
【附图说明】
[0017] 结合以下描述和附图可最佳地理解各实施方案以及其另外的目的和优点，在附图 中：
[0018] 图1为示出根据一个实施方案测定微生物对测检物的响应的方法的流程图；
[0019] 图2为示出图1中的连接步骤的一个实施方案的流程图；
[0020] 图3为示出根据一个实施方案的图1中的方法的附加任选步骤的流程图；
[0021] 图4为示出根据一个实施方案的图1中的方法的附加任选步骤的流程图；
[0022] 图5为示出根据一个实施方案的图1中的方法的附加任选步骤的流程图；
[0023] 图6为示出根据一个实施方案的图3中的方法的附加任选步骤的流程图；
[0024] 图7为示出图6中的测定MIC步骤的一个实施方案的流程图；
[0025] 图8为根据一个实施方案的微流体装置和含有微生物的3D培养基质的示意性概 览图；
[0026] 图9为根据一个实施方案的微流体装置的培养室和流体通道的示意图；
[0027] 图10为根据另一个实施方案的微流体装置的培养室和流体通道的示意图；
[0028] 图11为根据另一个实施方案的微流体装置的培养室和流体通道的示意图；
[0029] 图12为根据另一个实施方案的微流体装置的培养室和流体通道的示意图；
[0030] 图13为根据另一个实施方案的微流体装置的培养室和流体通道的示意图；
[0031] 图14为根据另一个实施方案的微流体装置的培养室和流体通道的示意图；
[0032] 图15为根据另一个实施方案的微流体装置的培养室和流体通道的示意图；
[0033] 图16示意性地示出根据一个实施方案的用于测定微生物对测检物的响应的系统 以及示出3D培养基质中浓度梯度形成的时间序列；
[0034] 图17A示出在贯穿含有大肠杆菌（E. coli)K12 MG1655的3D培养基质的氨苄青霉 素的线性梯度（从左到右为20-0 μ g/ml)形成后获取的3D培养基质的图像（黑色框指示 用于强度测量的选定区域）；
[0035] 图17B示出图17A中的选定区域的强度分布曲线，其中5 μ g/ml的强度增加指示 大肠杆菌K12 MG1655对氨苄青霉素的最小抑制浓度；
[0036] 图17C示意性地示出贯穿图17A的3D培养基质的氨苄青霉素的线性梯度 (20-0 μ g/ml)；
[0037] 图18A示出在贯穿含有大肠杆菌K12 MG1655的3D基质的壮观霉素的线性梯度 (从左到右为50-0 μ g/ml)形成后获取的3D培养基质的图像（黑色框指示用于强度测量的 选定区域）；
[0038] 图18B示出图18A中的选定区域的强度分布曲线；
[0039] 图18C示意性地示出贯穿图18A的3D培养基质的壮观霉素的线性梯度（从左到 右为 50-0 μ g/ml);
[0040] 图19为暴露于各种浓度的壮观霉素的大肠杆菌K12 MG1655随时间推移的生长曲 线的图；以及
[0041] 图20示意性地示出在微流体装置中用稳定和连续梯度的抗微生物剂培养细胞的 结果。
[0042] 发明详述
[0043] 在整个附图中，相同的附图标号针对相似或对应的元件使用。
[0044] 本发明的实施方案总体上涉及流体装置，具体地涉及此类流体装置在测定微生物 对测检物的响应中的用途。已得出的结论是诸如微流体装置的流体装置可被设计为特别适 合于监测或测定微生物对各种测检物的响应。更详细地讲，此类流体装置提供了快速测定 微生物对测检物或实际上对多种测检物的任意组合的响应的有效工具，所述流体装置具有 含有三维（3D)培养基质的培养室，所述三维培养基质包含相关微生物的培养物。
[0045] 此类流体装置具有使其成为非常有效的工具的关键特征。首先，可在3D培养基质 的至少一部分上快速准确地确立相关测检物的稳态梯度。这意味着连续范围的测检物浓度 是从3D培养基质的其中一个末端部分或侧面的高浓度降至3D培养基质的另一末端部分或 侧面的低浓度或零浓度来确立。因此，可用单一流体装置来测试测检物的连续范围的浓度。 这与其中可测试一种或少量预定浓度但不能测试任何连续范围的浓度的现有技术形成鲜 明对比。因此，可对例如抗生素的最小抑制浓度进行更精确的测定。
[0046] 其次，将微生物在3D培养基质中进行培养。因此，使得微生物以三维形式生长。这 继而在3D培养基质的存在活的和生长的微生物的区域与细胞死亡或低生长的区域之间提 供更佳显著的差异。因此，实施方案提供了增强的信噪比。因此，与微生物以生物膜的形式 在二维（2D)表面（较少的微生物可在该二维表面上生长，因此产生较低的检测信号）上生 长相比，更易于在3D培养基质中的不同区域或区之间进行区分。
[0047] 可在3D培养基质的至少一部分上快速地确立测检物的梯度。这连同微生物三维 生长的可能性允许在非常短的时间内（通常在一小时或最多