8)将小室放入95%乙醇中固定10分；（9)用 PBS轻柔冲洗小室表面的固定液，再将小室放入苏木素中染色5分钟；（10)小室放入1%盐 酸酒精中分化，自来水冲洗返蓝5分钟；（11)将小室放入伊红中染色5分钟，然后自来水冲 洗；（12)小室依次放入75%乙醇1分钟、85%乙醇1中分钟、95%乙醇1中分钟、100%乙醇4 分钟；（13)将小室风干，用刀片小心沿边缘切下小室底面的膜。膜底面朝上放在盖玻片上， 中性树胶封片；（14)在正置显微镜下观察，每张片在200 X下取8个随机视野，数出每个视 野中穿过的细胞数，进行统计分析，进行统计学分析。
[0032] 6、统计分析 应用SPSS20. 0 (IBMInc，USA)软件处理数据，所有数据用'x±s表示。多组间差异比 车父米用单因素方差分析，两两间比$父米用Dunnett-t检验，两组间比$父差异米用student-t 检验。检验水准a=0. 05。
[0033] 三、结果及结论 1、化合物（I )对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影响 生长曲线显示加入不同浓度的化合物（I )后，两种肾癌细胞株的增殖都受到了明显 的抑制。0. lmg/mL化合物（I )作用于786-0细胞24小时即出现显著的抑制生长作用 (Ρ〈0· 035)。随着培养时间的延长，0· lmg/mL化合物（I )及0· 25mg/mL化合物（I )对细胞 增殖保持明显的抑制作用，而〇. 5mg/mL化合物（I )使786-0细胞的增殖停滞。化合物（I ) 对0S-RC-2细胞的增殖同样有抑制作用，在培养第3天0. lmg/mL、0. 25mg/mL、0. 5mg/mL表 现出对0S-RC-2细胞的显著抑制（P分别为0. 026、0. 004、0. 002)。绘制的生长曲线显示化 合物（I )对786-0细胞株的增殖抑制作用较对0S-RC-2细胞的增殖抑制作用更为明显。生 长曲线周期中每天的细胞增殖情况见表1 (注：*在相应作用时间与对照组相比有统计学差 异（ρ〈0· 05))〇
[0034] WST-8细胞活力实验结果显示，化合物（I )对肾癌细胞株786-0细胞及0S-RC-2 细胞活力均有明显的抑制作用，化合物（I ) 〇. lmg/mL即在24小时对786-0及0S-RC-2细 胞的活力有显著的抑制作用，且与对照组比较差异有统计学意义。药物在24小时对两种细 胞的半数抑制浓度（IC 5。）分别为3. 5mg/mL和16. 45mg/mL，在48小时分别为为0· 165mg/mL 和I. 762mg/mL。对两种细胞的活性抑制作用见表2(注：*在相应作用时间与对照组相比有 统计学差异（P〈〇. 05))。
[0035] 2、化合物（I )抑制肾癌细胞株迀移和侵袭能力 细胞划痕迀移实验结果显示，化合物（I )对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2的迀移能 力有抑制作用，化合物（I ) 〇· 25mg/mL组在6h、12h、18h对786-0迀移的抑制率为10. 95%、 21. 96%和43. 02%，12h和18h的差异有统计学意义（P值分别为0. 004和0. 000);对0S-RC-2 的抑制率为3. 81%、19. 67%、28. 44%，12h和18h的差异有统计学意义（P值分别为0. 009和 0. 000)。化合物（I ) 0. 5mg/mL 组在 6h、12h、18h 对 786-0 的抑制率为 76. 82%、81. 18%、和 82. 62%，差异均有统计学意义（P值分别为0. 001、0. 000和0. 000);对0S-RC-2细胞的抑 制率为22. 01%、52. 95%、和61. 50%，12小时和18小时的差异均有统计学意义（P值分别为 0. 000和0. 000)。各组在对应时间的迀移率如表3。
[0036] Transwell细胞侵袭实验结果显示，经过12小时后，786-0细胞株加药组 (0. 25mg/mL化合物（I ))和对照组每个200X视野穿过的细胞数分别为262. 38±22. 13 和74. 75±10. 50,差异有统计学意义（P=0.00 0) ;0S-RC-2细胞株则分别为102. 75±8. 75、 65. 13±9. 66,且差异有统计学意义（P=0.00 0)。
[0037] 结论，本研究结果表明一定浓度的化合物（I )对肾癌细胞的增殖、迀移、侵袭、死 亡都有显著地影响，且在这些实验中对786-0细胞系的作用明显比对0S-RC-2细胞系更为 明显。表明这种药物也有可能通过这一机制对控制肾癌的进展和转移发挥一定的作用。
[0038] 表1化合物（I )对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影响
表2化合物（I )对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2抑制率的影响
表3化合物（I )对肾癌细胞株迀移和侵袭能力的影响
实施例3 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9 的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0039] 实施例4 口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸 或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
[0040] 实施例5 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量 比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0041] 实施例6 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌 封灭菌制成注射液。
[0042] 实施例7 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中， 搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得 粉针剂。
[0043] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：（a)将 粘毛鼠尾草干燥全草粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用 石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁 醇萃取物；（b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积， 再用75%乙醇洗脱8个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c) 步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、35:1、15:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分 离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤 (d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等 度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流提 取采用的乙醇浓度为80%。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗肾癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗肾癌的贝壳杉烷类二萜化合物物。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的贝壳杉烷类二萜化合物，可以从粘毛鼠尾草干燥全草中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物对肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭、死亡都有显著地影响，可以用来开发成治疗肾癌的药物。
【IPC分类】C07D493/10, A61K31/366, A61P35/00
【公开号】CN105384750
【申请号】CN201510647882
【发明人】叶澄
【申请人】温州泓呈祥科技有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月9日