一种抗人Delta-like4人源化抗体及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种抗人Delta-like 4人源化抗体H3L2及其制备与应用。
【背景技术】
[0002]信号通路
Notch通路是一条保守的信号转导途径，在多种组织和器官的早期发育过程中，对细胞的发育、生长及凋亡起着重要的调控作用。肿瘤干细胞生物学研究发现，Notch信号通路在肿瘤干细胞维持肿瘤的生长中发挥着关键的作用，在许多血液癌和实体瘤中发现了 Notch信号通路的异常激活。血管内皮细胞表达两种Notch受体(Notch-1和Notch-4)，以及除了DLL-3外的所有配体。其中DLL4是内皮细胞特异性配体，其介导的Notch-Ι信号通路对血管生成、发育起重要作用。许多血管生成信号因子(如VEGF)可以激活Notch-l/DLL4信号通路，激活的Notch-l/DLL4信号通路又会负反馈的下调VEGF受体VEGFR2的表达，从而抑制内皮细胞增殖和血管出芽。阻断DLL4介导的Notch-Ι信号通路则会引起内皮细胞增殖、血管过度出芽，产生管腔发育不完整的无功能血管，达到抑制肿瘤生长的效果。除此之外，还可以抑制肿瘤干细胞的增殖和自我更新，进一步防止肿瘤的生长和复发。
[0003]目前，靶向notch信号通路的临床研究药物主要有两大类，阻断γ-分泌酶的小分子抑制剂(GSI)以及革Ε1向notch受体、配体的单克隆抗体。大部分的GSI通过结合γ -分泌酶复合物的活性切割位点，从而竞争性的抑制γ -分泌酶对notch受体的切割，达到阻断notch信号通路的作用。然而GSI对notch的抑制是非选择性的，它可以抑制所有notch受体的切割，引起胃肠道的毒副作用。同样，靶向notChl、notCh2受体的单克隆抗体也会引起严重的胃肠道毒副作用。介导肠上皮细胞notch信号通路的配体主要是DLL1和DLL4，选择性的阻断DLL4介导的notch信号通路不仅可以达到抑制肿瘤的作用，还可以提高靶向特异性，减少对正常组织的毒副作用。
[0004]抗体人源化手段
鼠源单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的优势，但是应用于人体还有很大的缺陷如:1血清中半衰期短；2仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能；3最大的障碍是诱发HAMA反应。目前克服这些困难的首选途径是鼠单克隆抗体的人源化。最早的抗体人源化手段是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于这两部分在空间结构上相对独立，其抗原亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了下降，但由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区，应用于临床应用时仍可能发生强烈的HAMA反应。在此基础上，进一步将鼠单抗可变区中相对保守的FR区替换成人的FR，仅保留抗原结合部位CDR区，即CDR移植。然而起支架作用的FR不仅提供了 CDR的空间构象环境，有时还参加抗体结合位点正确构象的形成。因此，简单的CDR移植往往丧失或降低了原抗体的亲和力。近年发展起来的噬菌体抗体库技术通过PCR扩增人抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过吸附-洗脱-扩增过程筛选并富集特异性抗体。噬菌体抗体库技术筛选的抗体虽然为全人源的，但是相对于鼠源抗体亲和力和特异性仍不尚ο
[0005]立体结构数据和同源性分析表明:在抗原结合、稳定CDR构象、FR折叠这几个方面，构成抗体FR区的残基并不具有相同的重要性。获得抗体重、轻链可变区序列后，应用生物信息学技术模拟出抗体可变区的结构模型，在此基础上分析出对抗体构象维持起重要作用的碱基，选择性的进行回复突变。此方法补偿了完全CDR移植导致的亲和力丧失，是一种更为可靠的人源化手段。
[0006]本发明应用生物信息学软件Μ0Ε设计基于⑶R移植的FR区碱基回复突变人源化抗体，应用Μ0Ε模拟鼠抗体Fv区三维结构，并根据其三维结构分析维持CDR区构象必需的经典氨基酸，保留鼠单抗的⑶R区，根据FR区的经典氨基酸搜索人Fab sequencedatabase，查找最适FR模板替换鼠单抗FR区，在此基础上选择FR区重要的经典氨基酸进行回复突变。
【发明内容】
[0007]发明目的
本发明提供一种抗人DLL4人源化抗体H3L2及其制备方法和应用。
[0008]一种抗人DLL4鼠单克隆抗体可变区的人源化设计，保留鼠单克隆抗体重、轻链可变区的CDR区，利用生物信息学软件将FR区替换为高同源性的人源FR模板，并选择重要碱基进行回复突变，将得到的人源化可变区与人IgGl抗体恒定区，通过基因重组等手段构建成完整的人源化全长抗体(命名为H3L2)。
[0009]一种分离的核酸，其特征为编码H3L2抗体。
[0010]一种表达载体，含有上述的核酸。
[0011]一种重组CH0-S宿主细胞，含上述的表达载体。
[0012]一种哺乳动物细胞分泌表达法，用于分泌表达上述人源化抗体。
[0013]一种纯化上述抗DLL4人源化抗体的方法。
[0014]上述抗体或抗体片段的应用，其特征在于选择性的与人DLL4结合或抑制DLL4与notch受体的结合，阻断其信号通路的转导。
[0015]上述抗体或抗体片段或抗体片段的偶联物。
[0016]抗DLL4人源化抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0017]具体来说
本发明中抗DLL4人源化抗体H3L2由两条相同的重链H3和两条相同的轻链L2组成经典的抗体结构，重链碱基数为1404bp，轻链碱基数为708bp，人源化抗体蛋白分子量约为156KDa，其中人源碱基数占总碱基数的90%。重、轻链恒定区为人IgGl抗体恒定区，抗体可变区的人源化设计在分子建模/药物设计软件Μ0Ε上完成:首先将鼠源抗体FR区替换为高同源性的人源模板，得到CDR移植抗体，然而CDR移植抗体丧失了亲本鼠抗体的高亲和力。研究表明[Kettleborough C A, Saldanha J, Heath V J, et al.Humanizat1nof a mouse monoclonal antibody by CDR - grafting: the importance of frameworkresidues on loop conformat1n[J].Protein Engineering, 1991，4(7):773-783.]，FR区某些氨基酸对⑶R区构象、抗体亲和力的保持起重要作用，因此在⑶R移植抗体的基础上，我们选择了 12个FR区重要氨基酸回复突变为鼠源氨基酸以保证其亲和力，得到人源化抗体重、轻链可变区序列。
[0018]本发明利用酶切酶连技术，将设计合成的人源化可变区序列克隆到含有人IgGl抗体序列的表达载体，替换其可变区序列，构建成功的表达载体经电穿孔转染CH0-S细胞，经G418筛选、鉴定后得到稳定表达细胞株。取细胞表达上清，低温离心去除细胞碎片并抽滤后采用Protein A柱纯化；Western Blot鉴定所得H3L2抗体；流式细胞术检测H3L2与HUVEC细胞表面DLL4抗原的结合，SPR实验测定H3L2与人DLL4的亲和力常数；MTT检测H3L2阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用。一般认为鼠单抗可变区与人抗体恒定区组成的嵌合抗体与鼠单抗的亲和力相当，因此为了方便实验研究，我们选用嵌合抗体作为人源化抗体的阳性对照。
[0019]本发明成功构建了人源化抗体重、轻链的真核细胞表达载体H3- pMH3、L2- pMH3、H3-pCA、L2-pCA，筛选得到了稳定表达本发明人源化抗体的CH0-S细胞株，其表达的抗DLL4人源化抗体H3L2保留了鼠单克隆抗体的高亲和力(KD值约2.26X 10 12M);能与人脐静脉内皮细胞HUVEC具有高特异性结合；能够阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用。本发明为诊断和治疗以DLL4过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法。
[0020]有益效果
本发明利用生物信息学软件设计基于CDR移植的FR区重要碱基回复突变型人源化抗体可变区，将改造后的人源化抗体可变区与人IgGl型抗体恒定区拼接形成新的人源化全长抗体H3L2，将含有该人源化抗体基因的载体导入哺乳动物细胞表达系统CH0-S细胞中并获得稳定表达细胞株。大量表达并纯化H3L2，经SPR实验验证，H3L2与人DLL4抗原亲和力常数达到2.26X10 12M，基本上保留了鼠单克隆抗体的高亲和力；H3L2能特异性靶向人DLL4抗原，阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用，保留了亲本鼠单克隆抗体的生物学活性。
【附图说明】
[0021]图1是抗DLL4人源化抗体基因的设计。图为鼠单克隆抗体Fv区的三维结构，所标黄色氨基酸为FR人源模板替换后轻、重链中需要回复突变的经典氨基酸。轻链(左)中为41、47P、48W、50Y、72Y ;重链(右)中为 27Y、371、38K、481、68A、70L、98G。
[0022]图2是抗DLL4人源化抗体与鼠源抗体的氨基酸序列比对结果。Z27506和J00256为重链可变区的人源FR模板，X63399和J00242为轻链可变区的人源FR模板。
移植抗体的重、轻链可变区。*表示该氨基酸与鼠源抗体对应位点的氨基酸相同。标红色氨基酸为回复突变为鼠源的氨基酸，轻链中为41、47?、48￥、50￥、72￥;重链中为27Y、371、38K、481、68A、70L、98G。重链可变区中橙色区域分别为H-CDR1、H-CDR2，红色区域为H-CDR3 ;轻链可变区中紫色区域分别为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。 MMGZ01_VH/VL表示抗DLL4鼠源抗体的重、轻链可变区。CDR区的确定参考Kabat抗体注释规则[ffu, T.T., Kabat, E.A.; An Analysis of the Sequences of the Variable Reg1nsof Bence-Jones Proteins and Myeloma Light Chains and Their Implicat1ns forAntibody Complementarity; J.Exp.Med.132 (1970) 211 - 250.].图3是表达载体电穿孔转染CH0-S细胞后筛选稳定表达株的结