高效降解玉米赤霉烯酮的枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
【背景技术】
[0002] 玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，其化学名为6-(10-羟基-6-氧 基碳烯基）-雷锁酸-μ -内酯，是一种具有二羟基苯甲酸内酯结构的雌激素类真菌毒 素，通常由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum)、克地 镰刀菌（Fusarium crookwellense)等多种镰刀霉菌产生并释放到环境中。ZEN是世界上 污染范围最广泛的一种真菌毒素，在欧洲、南美洲、北美洲、亚洲、非洲以及大洋洲等世界各 地的谷物以及农副产品中都能检测到ZEN的存在。ZEN是由Baldwin等最先从发霉玉米中 分离得到，现已知其存在11种以上的衍生物。ZEN在玉米中可以11. 8mg/kg的极高浓度出 现，在燕麦、小麦、大麦和高粱中也被广泛检出。ZEN -般通过污染的植物饲料等进入食物 链，从而奶制品、牛肉和羊肉等中也可能以较高浓度出现，某些食物中ZEN的污染量甚至高 达289mg/kg。长期以来，有关ZEN污染危害的报道很多，其具有类雌激素活性，能引起种猪 等家畜或家禽生殖周期紊乱、家畜家禽早熟，给种植养殖业带来巨大损失。ZEN还具有强致 癌性，导致动物和人乳腺癌、食管癌等发病率增加，成为现今癌症发病率节节上升的原因之 一。目前ZEN的检测方法已较为成熟，但有关ZEN去除、转化等方面的问题迫在眉睫。
[0003] 迄今为止，国内外玉米赤霉烯酮的脱除方法主要有物理处理、化学方法和生物法 三大类。虽然物理、化学法处理脱毒有一定程度的效果，但其仍然存在着很多不足，比如脱 毒效果不理想，可能造成若干重要营养物质的损失，化学脱毒剂残留，成本较高，等等。利用 生物手段进行真菌毒素的降解则是近年来科技界研究的热点和焦点。生物方法是在温和的 条件下进行处理，从而使毒素的毒性减小，具有对原料的感官性状、适口性、营养物质影响 较小等优点。目前大部分国家对食品、谷物、饲料当中的ZEN含量都作了十分严格的规定， 例如澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50ng/g，意大利规定在谷物和谷类产品当中 ZEN的含量不能超过100ng/g，而在法国，植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200ng/g。
[0004] 综上所述，为解决农产品、饲料原料及饲料中ZEN污染问题，有必要从自然资源中 分离筛选安全、高效降解玉米赤霉烯酮的微生物菌种，进一步研究其生物特性，毒素降解特 性及降解机制，研发适用于饲料行业的玉米赤霉烯酮微生物脱毒剂，保证动物产品的食品 安全，减少种植业和养殖业的经济损失。现有技术中，"一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉 烯酮降解的应用"（中国专利公开号CN103937681A)中，将黑曲霉在适宜条件下培养5d，向 其中加入终浓度为2ug/ml的玉米赤霉烯酮，48小时，降解率达到89. 56% 一株铜绿假单 胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用"（中国专利公开号CN103981134A)中，将该铜绿假 单胞菌适宜条件下和终浓度为2 μ g/ml玉米赤霉烯酮培养72小时，降解率92. 75% 一株 解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用"（中国专利公开号CN103981133A)中， 将该株解淀粉芽孢杆菌在适宜条件下培养24小时，和终浓度为5 μ g/ml玉米赤霉烯酮加入 MM培养基共培养72小时，降解率为95. 99 %。
[0005] 与现有技术比较，本技术采用土壤中定向筛选得到的高效降解玉米赤霉烯酮的枯 草芽孢杆菌ASAGF141，能够在短时间内（6小时）将20 μ g/ml玉米赤霉烯酮完全降解，降 解率100%，具有降解速度快、降解完全的优点。由于该菌株可以在很短的时间内完全降解 ZEN，可作为微生物脱毒剂添加到动物饲料中，在动物肠道发挥作用降解ZEN。而现有专利中 菌株的降解时间均较长，不能在食物排出肠道前完全降解ZEN。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一株能快速高效降解玉米赤霉烯酮的枯草芽孢 杆菌及其应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明提供一株用于高效降解玉米赤霉烯酮的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，命名为ASAGF141 ;该菌株是从河南安阳地区种植玉米的土壤中分离得到，现已 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为：CCMCC NO. 9463,分类学命 名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏日期为2014年7月16日。与其它生物的情 况一样，本发明具有降解玉米赤霉烯酮活性的菌，ASAGF141仍然可能发生突变或变异。因 此，可以利用本领域已知的物理和化学方法得到该菌株的突变株，例如，可以通过用化学药 剂如亚硝基胍（NTG)及其它化学诱变剂，或用物理方法如紫外、Co 6。辐照处理得到其突变 株，这些诱变突变株，只要保留了降解玉米赤霉烯酮这样一个能力特征，也属于本发明的一 部分。
[0009] 本发明还提供一种菌剂，它的活性成分为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) ASAGF141(保藏编号为CGMCC No. 9463)或其衍生的突变株。本发明提供上述菌剂可以为液 态菌剂也可以为固态菌剂，并通过现有技术中已公开的制备方法来制备。具体地，本发明提 供上述菌剂的制备方法，该方法包括：
[0010] (1)将保藏编号为CGMCC No. 9463的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) ASAGF141或其衍生的突变株在固体培养基上活化；
[0011] ⑵将活化后的菌株接种于种子培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；
[0012] (3)将所述种子液接种于发酵培养基中，培养至稳定期，制得液态菌剂。
[0013] 进一步地，本发明还可以将上述液态菌剂直接喷雾干燥制得固态菌剂，或将液 态菌剂与吸附剂混合后干燥，制得固态菌剂。其中，所述液态菌剂与吸附剂的重量比为 1:2-10,所述吸附剂可以是玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、轻质碳酸钙或泥 炭中的一种或几种。
[0014] 进一步地，在上述制备方法中，用来培养枯草芽孢杆菌的发酵培养基（FM)可以有 多种形式的，但是综合考虑生产成本、细胞生物量、脱毒活性等方面，优选某些培养基，例 如，枯草芽孢杆菌ASAGF141优选的碳源为麦芽糖，但也可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、果糖、 半乳糖、甘露糖、糖蜜等。枯草芽孢杆菌ASAGF141优选的氮源为胰蛋白胨，但也可以使用牛 肉膏、玉米浆、酵母膏、酵母提取物等。可掺入培养基中的营养无机盐有能够产生下列离子 的常规可溶性盐：锌离子、钠离子、镁离子、钙离子、铁离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离 子、硝酸根离子等。
[0015] 进一步地，所述的种子培养基和发酵培养基（FM)需要121°C高温湿热灭菌后冷却 至30~35°C使用。
[0016] 进一步地，所述活化后的菌种按种子罐中种子培养基的0. 5~10%接种量接种入 种子罐；所述种子液按发酵罐中发酵培养基的〇. 5~10%接种量接种入发酵罐。
[0017] 进一步地，发酵培养条件为：无菌空气的通气量为1:0. 5~1. 2,搅拌速度为50~ 300转/分，培养温度约30~37°C，液态菌剂中活细胞数量至少达到IO7CFUAiI。
[0018] 本发明要求保护所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)ASAGF141、其衍生的突 变株及上述菌剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
[0019] 具体地，在降解玉米赤霉烯酮时，采用如下（a)或（b)方式中的任一种：
[0020] (a).将液态菌剂按照质量比1:1的配比喷施于玉米赤霉烯酮污染的谷物或者饲 料及饲料原料或其它农副产品，降解玉米赤霉烯酮，所述液态菌剂的活细胞数量至少达到 IO7CFlVml0
[0021] (b).将固态菌剂按照质量百分含量为1-5%的添加量加入到谷物或者饲料原料 及饲料中，混合均匀，降解玉米赤霉烯酮，所述固态菌剂的活细胞数量至少达到l〇 sCFU/g。
[0022] 所述谷物为玉米、大麦、稻谷、小麦或高梁。所述饲料原料及饲料为玉米、大麦、稻 谷、小麦或高梁等饲料原料及它们加工而成的饲料。所述其它农副产品为农产品加工副产 物如酒糟、果渣、淀粉渣等。
[0023] 本发明的优点在于：本发明提供的保藏编号为CGMCC No. 9463的枯草芽孢杆菌对 玉米赤霉烯酮有高效快速的降解作用。使用保藏编号为CGMCC No. 9463的枯草芽孢杆菌 生产降解玉米赤霉烯酮的固态或液态微生物菌剂，可以直接作为饲料添加剂加入饲料中使 用，也可以将微生物菌剂接种到饲料原料或饲料中进行固态发酵去除玉米赤霉烯酮，具有 生产使用成本低、简单、易操作，菌种安全，玉米赤霉烯酮降解安全、高效等优点。本发明提 供的菌株和菌剂可以用于谷物、饲料、饲料原料中玉米赤霉烯酮的去除，对于解决饲料及其 原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产和动物产品的食品安全、提 高畜牧业经济效益具有重要的意义。
【附图说明】
[0024] 图I ASAGF141在ZEN浓度为20 μ g/mL的FM(发酵培养基）中6小时后毒素降解 效果。
[0025] 图2 ASAGF141液体反应体系下，降解效果。
[0026] 图3 ASAGF141液态菌剂对谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果。
[0027] 图4 ASAGF141固态菌剂对谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例 中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说 明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
[0029] 实施例1枯草芽孢杆菌（Bacillus subtil