一株木质纤维素类物质高效降解菌l124及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株木质纤维素类物质高效降解菌L124及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是一个农业大国，农业废弃物产生量极其巨大，由于受经济效益和技术普及 的限制，农业废弃物大都粗放低效利用且闲置状况严重，造成资源浪费和环境污染，废弃物 已经成为中国最大的污染源。而农业废弃物存在着大量的木质纤维素，亟待人们去开发利 用。
[0003] 木质素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的有机可再生资源，也是微生物最难 降解的成分之一。近年来，某些降解木质素的真菌已开始在实际中得以应用，但仍有待进一 步开发。木质素微生物降解的应用主要有：造纸工业；饲料工业；发酵与食品工业；生物物 肥料环境保护；木素酶的生物漂白技术，等等。
[0004] 目前农业有机固体废弃通常通过能源化利用、有机肥料、禽畜饲料、可食用菌培养 基料和工业原料进行利用。在利用农业废弃物的生产实践中，物理、化学和生物处理方法经 常结合使用，而其中生物处理方法尤其是利用微生物处理代表了今后的发展趋势。生物处 理方法就是指利用木质素降解酶去降解木质纤维材料中的木质素，从而使木质素-半纤维 素-纤维素结构解体，纤维素得以暴露出来供后续步骤处理与传统的机械、物理化学类法 相比，生物处理法的优点是能耗低，所需环境条件温和，避免了传统化学处理、机械处理技 术等耗能较多、存在环境污染等缺点，从成本和设备角度考虑，生物脱木质素法占有独特的 优势。但是，目前的生物处理法有一个很大的弱点限制了它的应用，这就是生物处理法中的 关键角色-木质素降解酶的活性普遍不高，从而导致处理效率较低，如果能利用基因工程 和传统的生物技术对菌种和酶进行改造，提高酶活力，降低酶成本，生物法脱木质素法则有 望应用于大规模工业生产。
[0005] 而目前应用最广泛的是微生物菌肥，微生物菌肥作为一种新的农业技术措施，在 发展高产、优质、高效农业中的作用逐渐被人们所认识。传统的微生物肥料己经在大面积推 广应用中，新型的微生物菌肥品种不断开发出来。微生物肥是由具有特殊效能的微生物经 过发酵而制成的、含有大量有益微生物、对作物有特定肥效的特定微生物制品。微生物肥料 利用微生物的生命活动，将作物不能吸收利用的物质转化为可被作物吸收利用的营养物， 改善作物的营养条件，有些兼有刺激作物生长或增强抗病性的作用，以提高作物产量，改善 农产品品质。它既能增加农产品的出日创汇，又具有工农业有机废物有效利用、防止环境污 染、改进土壤结构、提高土壤肥力和保护生态良性循环的巨大社会效益和生态效益。
[0006] 国内的研究大多数为真菌降解木质纤维素。但是，利用真菌降解木质纤维素普遍 存在酶活力较低的问题。由于细菌繁殖较快，发酵周期短，可应用于工业生产，且细菌产生 的纤维素酶一般作用条件为中性或偏碱性，这在制浆、造纸和洗涤剂工业等污染行业的废 水治理上有着潜在的应用前景，因此从细菌中筛选出有效菌株应用于木质纤维素降解具有 一定的实际意义及开发前景。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了提供一株木质素高效降解菌L124及其应用。
[0008] 本发明的一株木质素高效降解菌为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月12日，保藏号CGMCC No. 10164。
[0009] 本发明的一株木质素高效降解菌L124用于降解木质素上。
[0010] 本发明的有益效果如下：
[0011] 本发明的霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124增殖迅速，适应性强，应 用广泛，耐盐性为NaCl浓度8%，耐热性为50°C ;连续传代培养10次，菌株生长情况、产 酶情况以及酶活力稳定，无退化现象；对袋料木耳废料和玉米秸杆具有明显的降解效果， 经霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei)L124发酵处理后的袋料木耳废料的失重率在 30%以上，经霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei)L124发酵处理后的玉米猜杆的失重 率在28%以上；具有明显的木质素降解能力和半纤维素降解能力，尤其可以高效降解木质 素。经复合微生物菌剂发酵处理的玉米秸杆中木质素含量是经霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei)L124发酵处理的玉米猜杆中木质素含量的1. 4倍，作为单一菌株霍氏肠杆菌 (Enterobacter hormaechei)L124对木质素的降解能力强于复合微生物菌剂；在降解样品 时，不影响样品中的主要元素含量，不会导致试样中的全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾含 量变化，保存样品肥效。
[0012] 本发明从袋料木耳废料、林间朽木和林间土壤中分离筛选出能够以木质素为唯一 碳源生长的原始菌株，确定对木质素的降解能力以及种属关系，为将来复合微生物菌剂构 建奠定基础。将为我国农业资源的有效化利用提供有力帮助。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124培养12h后的扫描电 子显微镜图（X20, 000);
[0014] 图2为16S rDNA序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000, 2泳道为菌株L124 ;
[0015] 图3为回收后的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000, 2 泳道为菌株L124 ;
[0016] 图4为阳性克隆子筛选的琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000, 2 泳道为菌株L124 ;
[0017] 图5为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei)L124的系统进化树；
[0018] 图6为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124对袋料木耳废料的失 重率图；
[0019] 图7为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124对玉米猜杆的失重率 图；
[0020] 图8为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124菌株降解后玉米猜杆 中各组分含量柱状图；其中，1为木质素含量柱状图；2为纤维素含量柱状图；3为半纤维素 含量柱状图；
[0021] 图9为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124菌株发酵处理后玉米 秸杆中全氮全磷和全钾含量柱状图；其中，1为全氮含量柱状图；2为全磷含量柱状图；3为 全钾含量柱状图；
[0022] 图10为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124菌株发酵处理后玉 米猜杆中速效磷含量柱状图；
[0023] 图11为本发明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei)L124菌株发酵处理后玉 米猜杆中速效钾含量柱状图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0024] 一：本实施方式的一株木质纤维素类物质高效降解菌L124,它为霍 氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月12 日，保藏号 CGMCC No. 10164。
[0025] 本实施方式的霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) L124为革兰氏阴性菌，该 菌株菌体形态为杆状，菌体大小为0. 55~0. 58 X 1. 4~1. 5 μ m，不形成芽孢，无鞭毛和荚 膜；在LB培养基上形成圆形、不透明、乳白色、突起光滑、边缘整齐的菌落（如图1所示）。
[0026] 该菌株的生理生化反应结果共18项、28个指标；结合形态与生理生化反应结果， 比对《伯杰氏细菌鉴定手册》确定该菌株的种属，结果如表1所示。
[0027] 根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的霍氏肠杆菌 (Enterobacter hormaechei) L124进行进行革兰氏染色、氧化酶、接触酶、焚光色素、甲基 红、七叶苷水解、明胶液化、石蕊牛乳胨化及产酸、脂酶、淀粉水解、V.P.测定、柠檬酸盐利 用、纤维素降解、3-酮基乳糖利用、苯丙氨酸脱氨酶、色氨酸脱氨酶、耐热热性、耐盐性生理 生化实验的检测和鉴定。结果表明霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei)L124为革兰氏 阴性菌，耐盐性为NaCl浓度8 %，耐热性为50°C，可产生接触酶，但不能产生氧化酶、脂酶、 苯丙氨酸脱氨酶、色氨酸脱氨酶和荧光色素，柠檬酸盐利用、七叶苷溶解解和石蕊牛乳产酸 表现为阳性，甲基红、V. P.试验、淀粉水解、明胶液化、石蕊牛乳胨化、纤维素降解和3-酮基 乳糖利用表现为阴性。
[0028] 表1菌株L124的形态学特征与生理生化鉴定结果
[0029]
[0031] 本实施方式的木质素高效降解菌为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei)L124 的筛选方法如下：
[0032] 1、筛选方法
[0033] 取IOg样品在无菌条件下充分研磨，加入装有90mL无菌水（带玻璃珠）的三角瓶 中，振荡20min。取5mL样品悬液接入装有IOOmL液体LB培养基的三