一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种冻存复苏液，特别是一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液。
【背景技术】
[0002]骨髓间充质干细胞是构建组织工程化骨重要的种子细胞，实现骨髓间充质干细胞的深低温保存对骨组织工程具有重要的意义。玻璃化冻存是使细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速率过冷到其玻璃化转变温度，而被固化为完全的玻璃态并以这种玻璃态在低温下长期保存的方法，在这一过程中细胞内外完全避免了结晶，从而得以避免由于结冰而引起的各种损伤。程序化冻存的复苏率只有5%~10%，而玻璃化冻存的复苏率>75%，因此玻璃化冻存是目前保存早期干细胞的重要方法。
[0003]但是玻璃化冻存存在着局限性。现有技术中玻璃化冻存剂通常采用DMS0，DMS0存在细胞毒性，从而引起细胞毒性损伤；复苏过程中还有可能引起保护剂的渗透性损伤，同时形成冰晶引起机械损伤，这些损伤都会大大降低冻存细胞的复苏率。
【发明内容】
[0004]本发明的发明目的在于:针对上述存在的问题，提供一种对骨髓间充质干细胞低细胞毒性，在玻璃化冻存复苏过程中低细胞毒性损伤，低渗透性损伤，提高冻存细胞复苏率的玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液。
[0005]本发明采用的技术方案如下:
本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.21%~0.23%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，
0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巯基乙醇和生理盐水。
[0006]由于采用了上述技术方案，细胞生长因子给为干细胞的分裂生长提供催化激素，从而提尚复苏率。
[0007]血清白蛋白及氨基酸等模拟人体环境，为干细胞复苏后提供一个适宜的环境，冲淡保护剂中的成分对干细胞的影响。
[0008]单糖为干细胞生长代谢提供养料，同时减小保护剂和复苏液的渗透压，减小在复苏过程中对干细胞造成的渗透损伤。
[0009]羟乙基哌嗪乙硫磺酸是pH缓冲剂，能够保证体系的pH恒定，同时羟乙基哌嗪乙硫磺酸无细胞毒性，对干细胞不会造成细胞毒性损伤。
[0010]本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，所述细胞生长因子为表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。
[0011]由于采用了上述技术方案，表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子能够促进干细胞分化生长。
[0012]本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，所述表皮生长因子的浓度为50~75Pg/L，所述酸性成纤维细胞生长因子的浓度为15~2(^g/L，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15~2(^g/L，所述血管内皮生长因子的浓度为4~6Pg/L。
[0013]由于采用了上述技术方案，浓度在上述范围内为适宜的范围，不会因激素含量过高导致细胞过快生长。
[0014]本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，0.8%的单糖，0.21%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，1.2%的非必需氨基酸，0.08%的L-谷氨酰胺，0.04%的β -巯基乙醇，0.68%的NaCl和75.49%的去离子水。
[0015]由于采用了上述技术方案，此为最佳比例一。
[0016]本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，1%的单糖，0.23%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，0.8%的非必需氨基酸，0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%的β -巯基乙醇和0.69%的NaCl和75.63%的去离子水。
[0017]由于采用了上述技术方案，此为最佳比例二。
[0018]本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，所述单糖为二羟基丙酮和L-甘油醛的混合溶液。
[0019]本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，所述单糖包括
0.3%~0.5%的二羟基丙酮和0.5%~0.7%的L-甘油醛。
[0020]综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:
1、降低了细胞毒性组分的含量，减小了在复苏过程中对冻存细胞造成的细胞毒性损伤。
[0021]2、添加细胞生长因子，从而促进干细胞分化生长，提高冻存干细胞的复苏率。
[0022]3、本发明的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的冻存保护剂，整体上提高了冻存的复苏率。
【附图说明】
[0023]图1是未冻存细胞和冻存后复苏细胞显微镜观测图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图，对本发明作详细的说明。
[0025]为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026]实施例1
如图1所示，一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，0.8%的单糖，0.21%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，0.8%的非必需氨基酸，0.08%的L-谷氨酰胺，0.03%的β -巯基乙醇，其余组分为生理盐水。
[0027]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0028]实验方法:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代。
[0029]步骤二:将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存24h。
[0030]步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%的单糖，0.21%的细胞生长因子，0.8%的非必需氨基酸，0.08%的L-谷氨酰胺，0.03%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ;
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0031]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0032]实验结果:测得复苏率为96.5% (图1上图为未冻存的干细胞，下图为冻存24h后复苏的干细胞)
实施例2
一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，1%的单糖，0.23%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，1.2%的非必需氨基酸，0.12%的L-谷氨酰胺，0.04%的β-巯基乙醇，其余组分为生理盐水。
[0033]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0034]实验方法:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代。
[0035]步骤二:将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~