一种酵母重组表达可溶性中国对虾swd抗菌肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酵母重组表达可溶性中国对虾SWD抗菌肽的方法，属于基因工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着抗生素的广泛应用甚至滥用，抗生素残留和细菌耐药性问题越来越受到全世 界的关注，尽快研发新型的抗菌药物来替代传统抗生素也成为世界性的攻关课题。
[0003] 抗菌肽是上世纪70年代在昆虫体内发现的一类具有抗菌作用的小分子多肽，在 大多数生物体内都有存在，它在无脊椎动物抵抗细菌、病毒、真菌等病原菌入侵中发挥着非 常重要的作用。抗菌肽因其抗菌谱广、不易产生耐药性、对正常真核细胞无毒害等优势，除 了可以用于药业，还可以用于食品、畜牧、水产养殖、日用化工等领域，所以，抗菌肽产品的 研发不仅对促进经济和社会的发展意义重大，而且也成为了抗生素替代品新药研发的热 点。
[0004] 尽管抗菌肽表现出巨大的新药发展潜力，但大多数抗菌肽作为药物生产还存在着 很多问题，比如无蛋白酶抑制活性而容易被蛋白酶水解、生物体内含量太低直接从生物组 织中分离纯化困难、原核表达的重组蛋白难溶、产量与活性不高等。目前，开发成功的抗菌 肽药物还非常少。
[0005] 2007年，在中国对虾中发现了 一种含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽（a single whey acidic protein domain-containing peptide，SWD)，具有广谱抗菌和蛋白酉每 抑制活性双重功能，显示出很好的药物研发前景。山东大学的王金星教授公开了该基因的 序列（见专利20051004458888)，并进行了原核表达。
[0006] 然而，原核表达产生的SWD重组蛋白是以不溶的包涵体形式存在(见论文Jia Y P， Sun Y D, Wang Z H, Wang Q, Wang X ff, Zhao X F, Wang J X. A single whey acidic protein domain (SffD)-containing peptide from fleshy prawn with antimicrobial and proteinase inhibitory activities. Aquaeulture, 2008, 284: 246-259)，要想利 用它必须经过复杂的变性、复性步骤，既降低了产率，也增加了工业化生产难度。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在克服原核表达方法的不足，提供一种毕赤酵母重组表达可溶性SWD抗 菌肽的方法，可以简单方便地生产SWD抗菌肽，利于SWD抗菌肽产品的产业化与应用。
[0008] 本发明的技术方案包括毕赤酵母重组表达载体的构建、酵母转化与阳性表达菌株 的筛选、SWD重组蛋白在毕赤酵母中的高密度分泌表达与纯化、表达蛋白的活性检测与应 用。
[0009] (1)毕赤酵母重组表达载体的构建：根据公开的中国对虾SWD抗菌肽基因的CDNA 序列（GenBank接收号EF216349)，设id 对上下游引物swd_f与swd_r，（所述两个引物的 5'端分别引入及I与Abi I酶切位点，同时，在下游引物swd-r的5'端引入6个组氨酸 密码子标签）；以其为模板，PCR扩增sro基因片段，将sro基因片段与表达载体pGAPZa -A 分别用此冰I与Afci I双酶切，把酶切产物纯化连接，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，转 化子在含有0. lmg/ml的Zeocin的低盐LB平板上生长，经PCR筛选阳性克隆、摇菌提质粒、 进行PCR与测序验证质粒中插入的基因序列正确后，即为构建好的iJ/pGAPZ a -A重组表 达质粒。 (2) 酵母转化与阳性表达菌株的筛选：新制备毕赤酵母GS115感受态细胞，用BspH I 酶切构建好的srJ/pGAPZ a -A重组表达质粒，使其线性化，酚氯仿抽提并乙醇沉淀回收线 性化的质粒，用脉冲电转化仪电转化新制备的毕赤酵母GS115感受态细胞，然后接种至含 有0. lmg/ml的Zeocin的YPD平板上，PCR筛选阳性克隆，转接阳性克隆到含0. lmg/ml的 Zeocin的YH)液体培养基里，30°C，270rpm振荡培养24h，按1:100比例转接到新的YPD 液体培养基中，同样条件下继续培养72h，离心收集酵母发酵液上清，经TCA沉淀的上清用 SDS-PAGE检测，有SWD目标蛋白表达带的阳性克隆即为σ -J/GS115阳性表达菌 株。 (3) SWD重组蛋白的表达与纯化：将筛选出的阳性表达菌株接种到含Zeocin 0.1 mg/ m的YH)液体培养基中，30°C，270rpm振荡培养至12h，按1:100比例转接到含Zeocin 0. lmg/ml的YPD液体培养基中，同样条件下继续培养24h，离心收集细胞，制备种子，转 接到新鲜YH)培养基里，同样条件下继续培养到表达高峰出现，将发酵液12000rpm离心 15min，4°C，收集上清，可以经冻干浓缩，用SDS-PAGE检测，有表达重组SWD抗菌肽的上清也 可以经His-tag凝胶亲和纯化柱纯化，获得比较纯和比较浓的SWD重组蛋白。
[0010] (4)表达蛋白的活性检测：1)抑菌活性检测：将浓缩的含SWD重组蛋白的发酵上 清液抽滤除菌为待测液，取10 μ 1待测液浸透直径约〇. 5cm的滤纸片，加盖到菌板（由处于 对数期的菌液8 μ 1与8ml的PB培养基混匀制成)上，37°C培养18h，揭掉滤纸片，结果发现 发酵上清液对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抑菌活性，出现了抑菌圈。2)抑蛋白酶 活性检测：接种枯草芽孢杆菌于5ml液体LB中，37°C摇床培养12h，稀释后取10 μ 1涂LB 平板，37°C过夜培养长出单菌落。挑枯草芽孢杆菌的单菌落于奶粉固体培养基(脱脂奶粉和 琼脂粉各1%)上，取10 μ 1待测液浸透直径约〇. 5cm的滤纸片，盖到菌落上，28°C培养24h， 结果有抑蛋白酶的透明带。也可以用96孔酶标板法检测待测液对枯草蛋白酶A的抑制活 性。本发明的毕赤酵母高密度分泌表达的SWD重组蛋白不仅对金黄色葡萄球菌、藤黄微球 菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有抑菌活性，还对枯草芽孢杆菌生长 过程中分泌的蛋白酶以及枯草蛋白酶A酶制剂有抑制活性。
[0011] 毕赤酵母表达系统是应用广泛的一种真核表达系统，可胞外表达外源蛋白。相比 大肠杆菌等原核表达系统，它具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能，而相比杆状病毒、哺 乳动物细胞的表达系统，它又具有培养成本低、产量高、便于产物分离纯化等优点。酵母表 达载体pGAPZ a -A是一种非诱导分泌型表达载体，表达的融合蛋白的N-端带有酿酒酵母 的α-因子分泌信号肽，能够使外源蛋白分泌到培养基中，且不需要甲醇诱导，而且，表达 的蛋白在分泌中能够自发切除所带的α-因子分泌信号肽，获得纯的外源蛋白，另外，含有 甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GAP)，比以往的醇氧化酶（AOX)启动子表达重组蛋白的水 平高，还带有Zeocin抗性标记，可以进行插入基因的高拷贝筛选。因此，把外源基因重组到 pGAPZ a -A中，再利用毕赤酵母表达外源蛋白，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。另外，毕 赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，有利于外源蛋白的分离纯化，加上 培养基价格低廉，便于实现工业化发酵生产。
[0012] 本发明的优点在于建立了一种酵母重组表达可溶性中国对虾SWD抗菌肽的方法。 本发明通过酵母发酵直接把SWD重组蛋白分泌在酵母的发酵液里，省去了添加诱导剂诱导 表达的繁杂步骤，使SWD重组蛋白便于工业化生产，获得的产品也避免了诱导剂的毒性，可 以直接利用，比如用作饲料添加剂应用到畜禽、水产等养殖业，也可以通过SWD重组蛋白上 的His标签进行亲和层析纯化，获得更纯的产品应用到食品、卫生、日用化工与医药业。
【附图说明】
[0013] 图1为用载体前引物a -Factor与基因后引物swd-r进行PCR鉴定连接产物转化 DH5a 的阳性克隆。其中，泳道 1 为 DNA marker (100, 250, 500, 750 最亮，1000, 2000bp)。 泳道2~13为301bp的克隆PCR产物。
[0014] 图2为本发明的sro/pGAPZ a -A重组质粒经PCR鉴定的结果。其中，泳道1为载 体前引物a -Factor与swd-r基因后引物的扩增带，2为基因特异引物swd-f与swd-r的 扩增带，3为载体后引物3' A0X-