一种海参组织蛋白酶的真核表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物蛋白酶制备领域，尤其涉及一种海参组织蛋白酶的真核表达方 法。
【背景技术】
[0002] 原胶蛋白是机体组织的结构蛋白，其诸多生理功能已被系统研究和广泛认可。随 着胶原蛋白产业的快速发展，胶原蛋白酶解工艺中的关键生产要素一蛋白酶的需求也不断 增长。目前较为常用的各类酶普遍存在胶原蛋白酶解效率不高的缺点，而运用基因工程技 术开发新型胶原蛋白酶可以弥补这一致命缺陷，且采用生物工程技术生产的胶原蛋白酶产 品品质易控、生产成本低廉。刺参具有极强的自溶能力究其本质即是组织细胞内蛋白酶对 体壁组织蛋白（主要为胶原蛋白）的高效酶解作用。然而，有关刺参组织蛋白酶基因的筛 选、功能研究及相关蛋白酶产品开发却尚未系统开展。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种海参组织蛋白酶的真核表达方法， 通过该方法表达的海参蛋白酶具有生产成本低、品质易控等特点，将增加胶原蛋白酶解蛋 白酶可选种类，提高酶解生产效益，具有重要的经济和社会价值。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种海参组织蛋白酶，该蛋白酶具有生产成本 低、品质易控等特点。
[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种海参组织蛋白酶的真核表达方 法，包括以下步骤：
[0006] (1)筛选组织蛋白酶基因 EST序列，以筛选出的片段序列为基础，采用RACE全长克 隆方法获取基因全长序列信息；
[0007] (2)通过全长序列信息预测分析编码蛋白结构特征及功能活性，查找确定关键结 构域；
[0008] (3)根据预测分析结果，确定接入表达系统的基因序列片段；构建宿主菌的真核 表达系统，体外表达目标蛋白；检测并阐明表达获得的蛋白酶活性功能特征。
[0009] 一种海参组织蛋白酶，根据上述一种海参组织蛋白酶的真核表达方法制备，其中 海参组织蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID :N0. 1所示。
[0010] 核苷酸序列SEQ ID :N0. 1如下：
[0011] CCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCC TGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGA ACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAAT ATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAAAGCCGTGCAAGGAACTTGCATGTACAAG TCGAGCTGCAACTCTGCTGATGTTGTCAAGTTCAACGATATTCCAACTGGTAACGAGATGGCACTTCAACAAGCTGT GGCTACCGTAGGACCTGTTTCTGTCGCCATAGACGCTGCTCTCAGTTCGTTCCATATGTACCATAGCGGTGTTTACG ATGACTCAATGTGCCGCAGCGACAGACAGCACTTGGATCACGGTGTGCTGGCGGTAGGTTACGGAACCATGGACGGG AAAGATTACTGGCTCGTTAAGAACAGCTGGGGCATGAGCTGGGGTGACCAGGGGTACATCATGATGTCTCGTAACAA GAACAACCAGTGTGGTATTGCAACTGCCGCCAGTTACCCAACTGTC
[0012] 本发明的有益效果是：通过该方法表达的海参蛋白酶具有生产成本低、品质易控 等特点，将增加胶原蛋白酶解蛋白酶可选种类，提高酶解生产效益，具有重要的经济和社会 价值。
[0013] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
[0014] 进一步，步骤（1)中具体包括如下步骤：
[0015] 根据已获得的刺参组织蛋白酶基因 EST序列片段，设计特异性全长克隆引物，采 用RACE技术扩增基因片段获得功能基因的全长cDNA序列，通过NCBI网站及蛋白翻译软件 等初步分析cDNA序列的正确性。
[0016] 进一步，步骤（2)中具体包括如下步骤：
[0017] 查找确定刺参组织蛋白酶基因全长序列的开放阅读框，确定编码序列并推测编码 蛋白的氨基酸序列，采用I 3DBSUM数据库预测分析蛋白二级结构、二硫键、配体结合位点等 结构信息，PROCAT数据库预测分析活性位点三维结构，NRL-3D数据库相似蛋白结构分析， SMART蛋白质结构功能域分析等，初步阐述基因编码蛋白结构特征，明确结构域位置。
[0018] 进一步，步骤（3)中具体包括如下步骤：
[0019] 根据已获得的全长基因序列开放阅读框信息序列信息，设计带有HindIII和 EcoR I酶切位点的特异性引物，以刺参体壁cDNA为模版，扩增获得目标序列；取扩增序列 克隆至PMD18-T载体中，获得带有目标克隆的载体后，采用HindIII和EcoR I双酶切，获取 目标克隆并连接至真核表达载体中，之后转化到表达宿主菌中，分泌表达目标蛋白。
[0020] 进一步，所述步骤（1)中用TA克隆方法进行DNA片段克隆：
[0021] 1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μ 1 ;
[0022] 试剂使用量：
[0023] pMD? 18-TSimpleVector*l ：1 μ I ；
[0024] InsertDNA*3 :0· Ipmol ~0· 3pmol ;
[0025] dH20 :upto5 μ I ;
[0026] 2)向步骤I)中加入5μ1的Solution〗，在16°C中反应30min ;
[0027] 3)将步骤2)中得到的溶液加入至100 μ 1DH5 α感受态细胞中，冰中放置30分钟；
[0028] 4)将步骤3)中得到的溶液在42°C加热45秒钟；
[0029] 5)将步骤4)中得到的溶液在冰中放置1分钟；
[0030] 6)向步骤5)中得到的溶液加入800 μ ILB培养基，37°C振荡培养60分钟；
[0031 ] 7)在步骤6)中得到的溶液中取100 μ 1菌液涂至含有Amp的LB-琼脂平板培养基 上培养，形成单菌落；
[0032] 8)在步骤7)中得到的单菌落中挑选单克隆，用含有Amp的LB-液体培养基培养并 送测序公司进行DNA序列检测分析。
[0033] 进一步，所述的真核表达载体为pPIC9K载体；所述宿主菌为毕赤酵母表达菌株。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发 明，并非用于限定本发明的范围。
[0035] 实施例1
[0036] 一种海参组织蛋白酶的真核表达方法，包括将海参组织蛋白酶的核苷酸序列克隆 至真核表达载体中，转化宿主细胞，进行诱导和表达的制备步骤，具体步骤如下：
[0037] (1)刺参组织蛋白酶基因全长克隆
[0038] 根据已获得的刺参组织蛋白酶基因 EST序列片段，设计特异性全长克隆引物，采 用RACE技术扩增基因片段获得功能基因的全长cDNA序列，通过NCBI网站及蛋白翻译软件 等初步分析cDNA序列的正确性。
[0039] (2)预测蛋白结构分析并确定真核表达的基因片段
[0040] 查找确定刺参组织蛋白酶基因全长序列的开放阅读框，确定编码序列并推测编码 蛋白的氨基酸序列，采用I 3DBSUM数据库预测分析蛋白二级结构、二硫键、配体结合位点等 结构信息，PROCAT数据库预测分析活性位点三维结构，NRL-3D数据库相似蛋白结构分析， SMART蛋白质结构功能域分析等，初步阐述基因编码蛋白结构特征，明确结构域位置。
[0041] 所确定的目标基因片段序列为：SEQ ID :N0. 1。
[0042] 核苷酸序列SEQ ID :Ν0· 1如下：
[0043] CCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCC TGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGA ACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAAT ATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAAAGCCGTGCAAGGAACTTGCATGTACAAG TCGAGCTGCAACTCTGCTGATGTTGTCAAGTTCAACGATATTCCAACTGGTAACGAGATGGCACTTCAACAAGCTGT GGCTACCGTAGGACCTGTTTCTGTCGCCATAGACGCTGCTCTCAGTTCGTTCCATATGTACCATAG