格氏乳球菌细菌素及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种格氏乳球菌细菌素及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 细菌素是某些细菌通过核糖体合成机制产生的分泌到环境中的一类具有抑菌活 性的蛋白或多肽。细菌素与抗生素的根本差别是大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害 作用，而且无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境。因此细菌素可以部分减 少甚至取代抗生素的使用。细菌素由于无毒、无副作用、无残留、无抗药性，并可以抑制或杀 死一些食物腐败菌，具有一定的热稳定性，易被人体消化道的部分蛋白酶降解，因此不会在 体内积蓄引起不良反应，也不会影响抗生素的活性，在食品中易扩散，使用较方便，同时也 不污染环境，因而受到食品、医疗、饲料等行业的青睐。
[0003] 细菌素的产量除了与菌株自身性质有关外，发酵条件对细菌素的产量有很大影 响，如培养基成分、有机溶剂、培养温度、培养时间、培养方式、起始P H值、接种量和接种种 龄等，其中以培养基成分、有机溶剂和培养温度影响较大。
[0004] 目前只有Nisin和pediocinPA-l/Ac H在工业中有应用，但由于这些细菌素只对 大多数革兰氏阳性细菌有抑制作用，但对革兰氏阴性细菌无作用，而且在酸性环境下不稳 定，这使得目前乳酸菌细菌的应用范围较窄，限制了其在食品中的应用。因此开发新型广 谱、抗菌活性强，稳定性强的乳酸菌细菌素已成为目前的发展趋势。
【发明内容】
[0005] 基于此，本发明的目的之一在于提供一种格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细 菌素的制备方法，该细菌素由格氏乳球菌（Lactococcus garviea)的发酵培养液提取得到。
[0006] 实现上述发明目的具体技术方案如下：
[0007] -种格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素的制备方法，所述格氏乳球 菌（Lactococcus garviea)细菌素由保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015633的格氏乳球菌 (Lactococcus garviea)的发酵液提取得到，包括以下步骤：
[0008] (1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌（Lactococcus garviea)在营养肉汤中活 化；
[0009] (2)格氏乳球菌的发酵培养：将活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)接 种于培养基中进行发酵培养，得发酵液；
[0010] ⑶细菌素的提取：调节步骤⑵得到的发酵液的PH值为8. 8~9. 6,放置Ih~ 4h后离心，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4. 7~6. 5,振荡Ih~4h后离心， 收集上清液；将上清液浓缩，冷冻干燥，即得到所述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细 菌素。
[0011] 在其中一些实施例中，步骤（2)所述培养基为改良的M17培养基，其成分为：L-阿 拉伯糖0.1 g~5g，植物蛋白胨5g~10g，酵母粉5g~10g，聚蛋白胨3g~7g，抗坏血 酸 0· 3g ~0· 7g，牛肉膏 1.0 g ~2. 0g，MgSO4 · 7H20 0· 005g ~0· 015g，β -甘油磷酸二钠 5g_15g，蒸馈水 1000mL。
[0012] 在其中一些实施例中，步骤（2)所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖 0. lg，植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0. 5g，牛肉膏1.5g，MgS04· 7H20 0. 01g，β -甘油磷酸二钠10g，蒸馏水1000mL。
[0013] 在其中一些实施例中，步骤（1)所述活化的时间为12h~48h，活化的温度为 32°C~45°C，活化的转速为IOOrpm~280rpm。
[0014] 在其中一些实施例中，步骤（2)将活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea) 按体积比为0. 5%~10. 0%的接种量接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养的时间为 12h ~144h，温度为 25°C~45°C，转速为 IOOrpm ~280rpm。
[0015] 在其中一些实施例中，步骤（2)将活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea) 按体积比为10. 0%的接种量接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养的时间为144h，温度 为32°C，转速为240rpm。
[0016] 在其中一些实施例中，步骤（3)的细菌素的提取方法为：调节步骤（2)得到的发酵 液的pH值为8. 8,4°C下放置Ih后离心，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4. 7， 在4°C下振荡Ih后离心，收集上清液；将上清液浓缩至原体积的1/2,冷冻干燥，即得到所述 格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素。
[0018] 具体技术方案如下：
[0019] -种格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素，由上述制备方法制备而得。
[0020] 本发明的另一目的在于提供上述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素的应 用。
[0021] 具体技术方案如下：
[0022] 上述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素在制备细菌抑制剂、真菌抑制剂 以及生物防腐剂中的应用，所述细菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，所述真菌为酵母、霉 菌。
[0023] 上述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素在制备防治急性肠炎或慢性肠炎 的药物中的应用。
[0024] 本发明的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)已于2015年10月22号保藏于武汉 大学保藏中心中国典型培养物保藏中心（CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山），保存期为三十 年，保藏编号CCTCC M 2015633。
[0025] 本发明筛选得到一种格氏乳球菌（Lactococcus garviea)，其保藏编号为CCTCC M 2015633,对该格氏乳球菌（Lactococcus garviea)的发酵液进行提取可获得抑菌范围 广的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素。本发明用含阿拉伯糖的培养基来诱导 培养格氏乳球菌（Lactococcus garviea)，再对其培养发酵液通过pH吸附法进行细菌素 的提取，可获得高产量的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素，IL发酵液可制备 800mg以上的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素。该格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素具有很强的广谱抑菌能力，对引起人类疾病以及食物腐败的一些革 兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和霉菌均有很强的抑制作用。本发明的格氏乳球菌 (Lactococcus garviea)细菌素具有治疗与预防急慢性肠炎的作用。本发明制备的格氏乳 球菌（Lactococcus garviea)细菌素还可以用于制备食品、医药、化妆品、饲料等行业防腐 剂。
【具体实施方式】
[0026] 以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0027] 以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，按本领域内常规方法和条件进行。 格式乳球菌（Lactococcus garviea)保藏在武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏编号CCTCC M2015633。
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例的一种格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素的制备方法，包括以 下步骤：
[0030] (1)格式乳球菌的活化：将格氏乳球菌（Lactococcus garviea)在营养肉汤中活 化48h，活化温度为32°C，转速为240rpm ;
[0031] (2)格式乳球菌的发酵培养：活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)按 10% (v/v)的接种量接种于改良的M17培养基中，发酵培养144h，培养温度为32°C，转速为 lOOrpm，得到发酵液；所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖0. lg，植物蛋白胨5g， 酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0· 5g，牛肉膏I. 5g，MgSO4 · 7H20 0· Olg，β -甘油磷酸二 钠 l〇g，蒸馏水1000 mL ;
[0032] (3)细菌素的提取：调节步骤⑵得到的发酵液的pH值为8. 8,4°C下放置lh，使 格氏乳球菌（Lactococcus garviea)充分吸附细菌素；在8000rpm下离心5min，收集菌体； 将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4. 7,在4°C下振荡lh，在8000rpm下离心5min收集上 清液；将上清液旋转蒸发浓缩至原体积的1/2后冷冻干燥，得到格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素 837mg〇
[0033] 实施例2
[0034] 本实施例的一种格氏乳球菌（Lactococcus garviea)细菌素的制备方法，包括以 下步骤：
[0035] (1)格式乳球菌的活化：将格氏乳球菌（Lactococcus garviea)在营养肉汤中活 化12h，活化温度为37°C，转速为240rpm ;
[0036] (2)格式乳球菌的发酵培养：活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)按 0. 5% (v/v)的接种量接种于改良的M17培养基中，发酵培养12h，培养温度为37°C，转速为 lOOrpm，得到发酵液；所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖5g，植物蛋白胨10g，酵 母粉l〇g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0· 5g，牛肉膏L 5g，MgS04 · 7H20 0· 01g，β -甘油磷酸二钠 l〇g，蒸馏水 l〇〇〇mL ;
[0037] (3)细菌素的提取：调节步骤⑵得到