一种高效表达重组八因子的灌注培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高效表达重组八因子的灌注培养方 法。
【背景技术】
[0002] 凝血八因子是目前治疗血友病A (Hemophilia A, HA)的唯一治疗方法，HA患者因 基因缺陷导致FVIII表达降低或功能缺陷，表现为凝血功能障碍和自发性出血。目前市售 有人血FVIII以及基因重组FVIII。但是人血FVIII产品仍然存在传播不明血源性病原体 的可能，因此，在重组DNA技术的日益发展进步下，重组FVIII产品越来越受到重视。
[0003] 重组FVIII是利用基因重组技术，将编码FVIII蛋白的基因片段插入质粒载体中， 而后将其质粒转入能够表达FVIII蛋白的哺乳动物细胞内。由于FVIII蛋白结构复杂，因 此必须选择哺乳动物宿主细胞作为FVIII的表达载体。与细菌或酵母细胞不同，哺乳动物 细胞具有翻译后修饰功能，例如溶蛋白性裂解、糖基化作用、羟基化作用及硫酸盐化作用， 这些功能是形成具有活性的FVIII蛋白二、三级结构所必须的。但是由于FVIII是个特殊 的蛋白，糖基化比较复杂，蛋白不稳定，在培养过程中受温度等培养条件影响很大，为了在 发酵过程中保证rFVIII的浓度以及质量，需要采用灌注培养的方式。
[0004] 灌注培养是指把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成的 过程中，不断地将部分培养基取出，同时又连续不断地灌入新的培养基的细胞培养方式。连 续的灌注培养可以提供给细胞充分的营养成分，同时带走代谢副产物，给细胞的生长提供 优良的环境，维持较高的细胞密度，使得细胞表达时间延长，可以大幅度提高生产产率。
[0005] 实现细胞灌注培养的核心技术是如果有效地对细胞进行截留，即在保证细胞密度 和活力的基础上更换培养基。目前，常用的利用细胞截留装置达到细胞灌注培养的方法主 要有：倾斜式重力沉降设备、离心细胞分离装置、旋转过滤灌注设备（Spin filter)、声频灌 流装置、中空纤维柱细胞截留装置等。虽然能够适用的方法种类较多，但是这些方法均有非 常明显的缺陷。
【发明内容】
[0006] 如上所述，现有技术中的各种方法均有非常明显的缺陷。所以鉴于以上所述现有 技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，用于解决 现有技术中的问题。本发明所提供的高效表达重组八因子的灌注培养方法能够同时充分发 挥截留方法和重组FVIII的灌注培养生产工艺的优势，达到提高并维持细胞生长密度、延 长生产周期、增加 FVIII的产量、并保证FVIII的质量的效果。
[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种高效表达重组八因子 的灌注培养方法，包括如下步骤：
[0008] 1)将重组FVIII细胞株的种子接种于反应器中进行批培养；
[0009] 2)当培养体系中葡萄糖含量为0. 5-1. 5g/L时，使用旋转过滤灌注方法进入灌注 培养模式；
[0010] 3)当反应器内的细胞处于一个稳态阶段，使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法 同时进行灌注培养，维持细胞密度在2-3*10 7个/ml。
[0011] 本领域技术人员可根据重组FVIII细胞株的种类和具体实验需求，选取合适的条 件对重组FVIII细胞株的种子进行扩增，并进一步将扩增所得的产物用于步骤1的接种过 程中。
[0012] 所述旋转过滤灌注方法具体指：将一个旋转过滤器（旋转过滤灌注设备、Spin filter)按放在反应器的旋转轴上，进行灌注培养。
[0013] 所述旋转过滤灌注方法培养过程中培养基从筛面通过，细胞位于筛面外，在旋转 过滤笼内有吸取管，能够将笼内的培养液栗出，从而达到调整培养液参数的目的。
[0014] 所述使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法同时进行灌注培养具体指：将一个旋 转过滤器（旋转过滤灌注设备、Spin filter)按放在反应器的旋转轴上，同时在反应器上 安装声频灌流装置，进行灌注培养。
[0015] 所述使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法同时进行灌注培养的过程中，培养基 从筛面通过，细胞位于筛面外，在旋转过滤笼内有吸取管，能够将笼内的培养液栗出，同时 基于声频引起细胞聚集的新型细胞截留装置，是利用声频使细胞聚集后沉淀，促使胞液分 离，不仅截留效率高，而且不易堵塞，易于清洗和灭菌，而且在培养过程中，可以将部分细胞 碎片与上清液一起分离出反应器。
[0016] 本发明所提供的灌注培养方法可使用各种市售的旋转过滤灌注设备和/或声频 灌流装置，本领域技术人员可根据反应体系的具体参数选择合适的旋转过滤灌注设备和/ 或声频灌流装置用于灌注培养。
[0017] 优选的，所述步骤1中，批培养的培养体系体积为4. 9-5. 1L。
[0018] 优选的，所述步骤1中，接种后培养体系中的细胞密度为0. 6-1. 0*106个/ml。
[0019] 本领域技术人员可根据重组FVIII细胞株的种类选择合适的培养条件进行批培 养，在本发明一实施例中，批培养的具体条件为温度37°C、pH 6.9、溶氧（D0)30-50%、初始 转速90转/min。
[0020] 优选的，所述步骤2中，当培养体系中葡萄糖含量为0. 8-1. 2g/L时，使用旋转过滤 灌注方法进入灌注培养模式。
[0021] 优选的，所述步骤2中，灌注培养的培养体系体积为4. 9-5. 1L。
[0022] 优选的，所述步骤2中，灌注培养模式期间，保持葡萄糖含量在0. 8-1. 2g/L。
[0023] 优选的，所述步骤2中，保持培养体系中的细胞密度在1-2*107个/ml。
[0024] 本领域技术人员可根据培养体系和反应情况选取合适的方法从培养体系中抽取 部分细胞，以是培养体系的细胞密度维持在目标区间。
[0025] 优选的，所述步骤2中，灌注培养模式的培养时间为10-15天。
[0026] 优选的，所述步骤3中，灌注培养的培养体系体积为4. 9-5. 1L。
[0027] 优选的，所述步骤3中，维持细胞密度在2. 0-3. 0*107个/ml。
[0028] 本领域技术人员可根据培养体系和反应情况选取合适的方法从培养体系中抽取 部分细胞，以是培养体系的细胞密度维持在目标区间。
[0029] 优选的，所述步骤3中，灌注培养的培养时间为多60天。
[0030] 本领域技术人员可根据重组FVIII细胞株的种类选择合适的培养条件进行灌注 培养，在本发明一实施例中，灌注培养的具体条件为温度37°C、pH 6. 9、溶氧（DO) 30-50 %。
[0031] 本发明第二方面提供所述高效表达重组八因子的灌注培养方法在凝血八因子制 备领域的用途。
[0032] 本领域技术人员可根据反应体系的具体情况选取合适的提纯方法对步骤3的反 应液进行处理，制备获得凝血八因子产品。
[0033] 如上所述，本发明所提供的高效表达重组八因子的灌注培养方法采用声频灌流方 法和旋转过滤灌注方法相结合灌流培养，先将扩增所得的重组FVIII细胞株的种子接种并 进行批培养，待反应器内营养物质消耗到一定水平（以检测葡萄糖含量为衡量标准），先打 开旋转过滤灌注设备进入灌注培养模式，而后到达一定细胞密度后再打开声频灌流装置进 行双系统灌注培养，并在培养过程中不定期抽去部分细胞，使反应器内的细胞保持一个合 适的细胞密度。本发明所提供的灌注培养方法取两种细胞截留方式的长处，互补不足之处， 发挥最大的灌流效率。在细胞增殖生长期，先使用旋转过滤灌注设备进行灌注培养，可以避 免声频灌流装置在低密度条件下将细胞过多的带出反应器中，导致细胞数量有一个骤减的 过程。而后达到一定细胞密度后，打开声频灌流装置，可以同时利用两个截留系统进行灌注 培养，一方面有了旋转过滤灌注设备，使得可以让声频灌流装置在有效范围内达到最优的 灌注体积，并且增加了反应器内溶氧的传递；另一方面，培养过程中产生的细胞碎片，在声 频灌流装置的作用下离开反应器，使得反应器内的细胞活率处在一个较高的水平。
【具体实施方式】
[0034] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0035] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0036]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0037] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego, 1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. ffassarman and A. P. ffolffe,eds. ),Academic Press,San Diego, 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0038] 实施例1
[0039] (I)细胞的接种
[0040] 细胞库中复苏一支表达重组FVIII的细胞株