一种快速鉴定双歧杆菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及双歧杆菌，尤其是一种快速鉴定双歧杆菌的分 子生物学方法。
【背景技术】
[0002] 双歧杆菌是一类厌氧的革兰氏阳性细菌，按照伯杰细菌鉴定手册的分类，双歧杆 菌属于放线菌目放线菌科双歧杆菌属。双歧杆菌为外观变化很大的杆状体，菌株的一般特 征是呈分叉的Y型或V型，以及棍棒状或者匙状类型。1899年，法国巴斯德研究院人员首先 从母乳喂养的婴儿粪便中分离出了第一株双歧杆菌，之后越来越多的科学家及研究者们开 始了对双歧杆菌的研究工作。并且实践表明，双歧杆菌是存在于人和其它动物肠道内的一 类有益菌，人体肠道内双歧杆菌的数量，在婴幼儿时期含量最为丰富，随着年龄的增长，比 例逐渐缩小。定殖于人体肠道内的双歧杆菌，在抑制有害菌群、维持肠道菌群平衡、促进肠 道蠕动、改善便秘、缓解由抗生素引起的腹泻、提高宿主免疫力等方面发挥着重要的作用。
[0003] 随着对双歧杆菌研究的深入，以及对双歧杆菌类产品的开发，如何快速获得具有 潜在益生特性的双歧杆菌菌株成为亟待解决的问题。而对于双歧杆菌的鉴定，是其中不可 或缺的重要部分。目前，对于双歧杆菌的菌种鉴定，常用的方法主要有两种：一是基于形态 学和生理生化特性（主要是糖代谢不同）进行的传统鉴定方法；二是基于分子生物学手段， 对菌株的基因进行测定，其中最常用的是PCR扩增双歧杆菌的16S rDNA片段，将双歧杆菌 鉴定到种的水平。然而，这两种方法在一定程度上都存在某种不可避免的缺陷性。传统的 形态学及生理生化鉴定方法，由于双歧杆菌的形态多变性以及代谢底物的细微差别，很难 将双歧杆菌鉴定到种的水平。并且存在工作量大，费事费力的缺点。而采用16S rDNA片段 进行测序的方法，虽然可以准确鉴定到种，但存在程序繁琐的缺点。
[0004] 变性梯度凝胶电泳（DGGE)的工作原理是，根据DNA的解链特性，不同碱基组成的 双螺旋DNA发生变性所需变性剂的浓度不同。混合的双链DNA在进行变性剂浓度呈线性变 化的电泳时，相同碱基组成的DNA在同一变性剂浓度的位置发生解链，不同碱基组成的DNA 在不同变性剂浓度的位置发生解链，由于迀移速率的不同而停留在凝胶中的不同位置，从 而将混合的DNA片段分离开来。此技术可以将仅有一对碱基差别的DNA片段分离开来。而 双歧杆菌的16S rDNA的V3区为高度可变区，理论上可以通过DGGE手段将不同种的双歧杆 菌鉴定出来。
[0005] 通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
[0006] -种鉴定双歧杆菌的方法（CN102108400A)，涉及一种鉴定双歧杆菌的方法，具体 涉及一种新的鉴定双歧杆菌的分子生物学方法。该方法通过对双歧杆菌16S rDNA上两段 目标基因片段及丙酮酸激酶编码基因上一段目标基因片段的PCR扩增和测序分析，可以将 双歧杆菌菌株鉴定到种的水平。本发明将为双歧杆菌鉴定提供一种更加准确、更易于操作 的实用方法，有利于双歧杆菌菌株的分类及研究工作。
[0007] 通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速、准确地鉴定双歧杆 菌的方法，该方法可以将双歧杆菌鉴定到种或亚种的水平，为双歧杆菌的分离鉴定及进一 步研究提供一种可靠手段。
[0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0010] -种快速鉴定双歧杆菌的方法，采用PCR-DGGE的方法，将未知菌株与标准菌株的 条带进行比对，将未知双歧杆菌鉴定到种或亚种的水平。
[0011] 而且，步骤如下：
[0012] ⑴提取已知基因序列的不同种双歧杆菌的基因组；
[0013] ⑵采用合适引物对，进行PCR扩增单菌的16S rDNA的V3区；
[0014] ⑶采用变性梯度凝胶电泳方法构建标准指纹图谱；
[0015] ⑷将未知的双歧杆菌条带与标准条带进行比对，确定未知双歧杆菌的种类。
[0016] 而且，所述步骤⑴中已知基因序列的双歧杆菌为短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物 双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种。
[0017] 而且，所述步骤⑴中提取双歧杆菌基因组的方法是酚-氯仿抽提法。
[0018] 而且，所述步骤⑵中引物对为338f-GC和518r。
[0019] 而且，所述引物338f-GC的碱基序列为5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGGAGG CAG CAG-3' ；引物 518r 的碱基序列为 5' -ATTACC GCG GCT GCT GG-3'。
[0020] 而且，所述步骤⑵中PCR的扩增条件为：95°C，5min ;94°(：，458,65°(：，458，每个循 环降 0· 5°C，72°C，30s，20 个循环；94°C，50s，55°C 55s，72°C 30s，15 个循环；72°C lOmin。
[0021] 而且，所述步骤⑶中变性梯度凝胶电泳方法所用的胶为30%~70%的聚丙烯酰 胺。
[0022] 而且，所述步骤⑶中变性梯度凝胶电泳方法的电泳条件是：120V，30min ;80V， 12h ;缓冲液为I XTAE ;温度为60°C。
[0023] 而且，具体步骤如下：
[0024](一）培养基与培养条件
[0025] 培养基：MRS+5%。半胱氨酸，121°C灭菌15min ;培养条件：37°C，于厌氧工作站培养 24h，得菌悬液；
[0026] (二）基因组提取
[0027] ⑴取培养过夜的菌悬液ImL于I. 5mL离心管，1000 Orpm离心2min，弃上清得菌体；
[0028] ⑵用ImL无菌水吹打洗菌体后，1000 Orpm离心2min，弃上清得菌体；
[0029] ⑶向菌体中加入200uL SDS裂解液，80°C水浴30min，得菌体裂解液；
[0030] ⑷加入酚-氯仿溶液200uL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体 积比为：Tris饱和酸：氯仿：异戊醇=25 :24 :1，颠倒混勾后，12000rpm离心5-10min，取上 清 200uL ;
[0031] (5)加入400uL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，-20°C静置lh，12000rpm离心 5-10min，弃上清；
[0032] (6)加入500uL体积百分数为70%的冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心l_3min，弃上 清；
[0033] (7) 60°C烘箱烘干，或者自然晾干，得沉淀；
[0034] (8) 50uL CldH2O 重溶沉淀，以备 PCR ;
[0035] (三）1防rDNAV3区引物
[0036] 上游引物 338f-GC，碱基序列：SEQl (5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGGAGG CAG CAG-3' ）；
[0037] 下游引物 518r，碱基序列：SEQ2(5' -ATTACC GCG GCT GCT GG-3'）；
[0038] (四）PCR 反应体系 50 μ L :
[0039] IOXTaq buffer, 5 μ L ；dNTP, 5 μ L ；338f-GC 20 μ Μ, 0. 5 μ L ；518r 20 μ Μ, 0· 5 μ L ;Taq 酶，0· 5 μ L ;DNA 模板，0· 5 μ L ;ddH20, 38 μ L ;
[0040] (五）PCR反应程序
[0041] 95°C，5min ;94°C，45s，65°C，45s 每个循环降 0· 5°C，72°C，30s，20 个循环；94°C， 50s，55°C 55s，72°C 30s 15 个循环；72°C，保持 IOmin ;
[0042] (六）琼脂糖电泳
[0043] (1)配制质量百分数1 %的琼脂糖凝胶：每大胶40mL，称取0. 4g琼脂糖置于锥形瓶 中，加入40mL的0. 5XTBE，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，待溶液冷至不烫手， 加入4 yL 10000X的核酸染料，混匀后倒入模具中，凝固30min以上；
[0044] ⑵将基因组DNA样品/PCR产物样品与10XLoading buffer混合后，加入样品槽 中；
[0045] ⑶接通电源，120V，跑30min ;
[0046] ⑷电泳结束后，用凝胶成像仪拍照；
[0047](七）变性梯度凝胶电泳的操作
[0048] ⑴溶液配制
[0049] ① 50XTAE 电泳缓冲液：tris 242g，Na2EDTA · 2Η2037· 2g，加 800mL 去离子水，充 分混匀，加57. Im