可调节的基因表达的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可调节的基因表达构建体和在体内选择程序中采用所述可调节 的基因表达构建体的方法。
【背景技术】
[0002] 生物催化剂是可以活化或加速化学反应速率的、生物产生的催化剂。在化学工业 中，特别是在造纸、皮革、个人护理和去污剂工业中，生物催化正在变成越来越重要的工具 (Sanchez和Demain, 2011)。生物催化剂可以包含全细胞系统以及分离的酶；后者通常被分 类为工业酶和生物转化酶。
[0003] 生物催化酶在有机合成方法中起甚至更重要的作用。用包括一个或多个生物催化 步骤的方法制造越来越多数目的工业产品（从药物中间体到散装化学物质），从而预言重 要的基于生物技术的化学工业的出现。
[0004] 基于生物催化剂的化学工业的持续成功依赖于增加能够实现良好总过程效率和 低生产成本的生物催化剂的可用性。这需要连续开发在实用工艺条件下表现出对于期望的 生物转化而言必要的活性和稳定性的细胞系统和/或酶。
[0005] 在学术界中（其中研究中心聚焦于最近已经变得普及的生物催化）和在工业界中 (其中越来越多数目的年轻生物技术公司和建立的药物和化学公司现在正在开发新生物催 化剂），许多努力致力于发现或开发满足这些标准的酶。
[0006] 大体而言，在生物圈中可得到的生物催化多样性是无限的。使用例如DNA改组技 术、定向进化技术或定位诱变技术，可以在实验室中合成地扩展该天然多样性。酶发现和优 化的策略通常基于筛选这些资源。通过从自然界中广泛地和持续地筛选大量微生物，已经 发现了所有应用的生物催化剂，包括用于大规模生产化学物质和药物的工业酶以及生物催 化剂（Lorenz和Eck，2004)。但是，在该巨大库中发现期望的生物催化剂目前利用缓慢的且 昂贵的筛选技术，所述技术限制了新生物催化剂的开发。
[0007] 显然需要改进的生产生物催化剂的方法。用于建立新优化的生物催化剂的合理重 新设计是特别挑战性的。存在几个例子（Nestl, Nebel和Hauer, 2011)，但是贡献仍然较小。 甚至重新设计现存酶来产生新优化的生物催化剂仅取得有限的成功（N. J. Turner，2009)。 但是，这样的方案仍然在它们的幼年期，且仍然可能证实在适当的时机是更有效果的。
[0008] 酶发现的初期通常包括在实验室中筛选可得到的微生物培养物。但是，据估测，通 过当前实验室程序可以培养小于在自然界中的所有微生物的1%，可能由于未得到满足的 复杂营养需求或共生相依性（Kaeberlein, Lewis和Epstein, 2002)。
[0009] 允许环境DNA的分离、克隆和重组表达的技术已经使得从不可培养的生物体基于 活性而筛选酶成为可能（Lorenz等人，2003)。该总程序遵循4个主要步骤：
[0010] 1.从天然底土层提取DNA。
[0011] 2.将DNA片段化至多种尺寸，所述尺寸取决于文库的目的。对于基于表达的筛选， 通常使用l_120kb，并将其克隆进载体诸如质粒、F粘粒、粘粒、噬菌体和BAC中。
[0012] 3.对于功能筛选/选择策略，将基因文库克隆进替代宿主中以构建宏基因组表达 文库。
[0013] 4.通过筛选/选择，评价具有独特插入物的细胞的文库。
[0014] 该程序会制备IO6-IOw个变体的宏基因组文库，这极大地增加了产生期望的生物 催化剂的微生物的存在的可能性。但是，仍然有待解决的问题是，如何为期望的生物催化剂 成功地和容易地筛选如此巨大的变体文库。
[0015] 用于酶鉴别的文库评价
[0016] 对于基于活性的筛选，文库评价通常存在两个选择：高通量筛选（HTS)和体内选 择。
[0017] Aharoni等人（Curr. Op. Chem. Biol.，2005)公开了通过使用定制测定使酶活性可 视化的HTS方法，所述定制测定包括用目标酶将发荧光底物或生色底物转化成光谱上不同 的产物。
[0018] Leemhuis等人（IUBMB life, 2009)综述了多种HTS技术，包括FACS、在微滴中的 细胞、细胞表面展示和具有超高通量能力的体外区室化。已经发现这样的技术会产生高水 平的假阳性结果（Dietrich, McKee 和 Keasling, 2010)。
[0019] 使用HTS方法的一个显著缺点是，这样的筛选方法经常需要单独地试验文库的每 个个体，这意味着该方法经常依赖于昂贵的自动化。
[0020] Sommer、Dantas 和 Church (Science 2009, Mol. Sys. Bio. 2010)公开了针对抗性 / 脱毒基因（诸如抗生素抗性基因和增加对生长抑制剂的耐受性的基因）筛选宏基因组的体 内选择方法。Steele、Jaeger、Daniel 和 Streit (J. Mol. Microbiol. Biotechnol.，2009)综 述了体内选择方法。
[0021] 通常，体内选择方法要求表达的酶给宿主细胞赋予显著的生物优点，诸如允许宿 主细胞在生长抑制条件下生长。
[0022] EP 1801212 (ETHZ，2005)公开了从候选生物催化剂群体中选择能够催化从底物至 产物的化学反应的生物催化剂的体内方法，所述方法包括：提供包含产物诱导的表达系统 和生物催化剂表达系统的宿主细胞，和在生长抑制条件下培养所述宿主细胞。含有期望的 生物催化剂的细胞会实现底物至产物的化学转化，所述产物结合至产物诱导的表达系统， 其表达允许在生长抑制条件下增殖并因此实现所述生物催化剂的选择。该系统对于较小细 胞群体（约IO 5个细胞）而言是有效的，但是对于较大群体而言不太有效，用包含约10 6个 细胞的文库观察到10-30 %假阳性。
[0023] Yang等人（Nature Communications, 2012)公开了使用结合赖氨酸的合成核糖开 关从宿主细胞群体中选择产生高水平的赖氨酸的那些细胞（区别于不产生高水平的赖氨 酸的那些细胞）的方法。
[0024] US 2013/0310458公开了一种遗传修饰的细胞，其包含可操作地连接到核糖开关 的编码自发荧光蛋白的基因序列，其中所述自发荧光蛋白的表达依赖于适体结合代谢物的 细胞内浓度。
[0025] Gallivan(J. A. Chem. Soc.，2004)提供了一种使用合成核糖开关的方法，所述 合成核糖开关在有茶碱存在下活化编码抗生素抗性的编码区的翻译，从而允许携带所述 核糖开关的细胞的增殖。证实了从大百万倍的含有突变体核糖开关的细胞库中选择携 带对茶碱具有特殊配体特异性的所述合成核糖开关的细胞。一种类似的方法公开在US 2012/0244601(Gallivan，2012) 〇
[0026] 可以预见到，可以进一步开发在上面引用的【背景技术】中的选择程序以检测转运蛋 白化合物-将底物从细胞外空间转运进细胞内空间中的化合物。可以使用产物诱导的选 择系统选择将所述产物（其不能发生被动细胞扩散）从细胞外空间转运进细胞中的化合 物。当工程化需要所述底物的体内生化合成时，不能从细胞外空间被动扩散至细胞内空间 的底物可能产生问题，因此提供用于选择编码跨细胞膜转运特定底物（'产物'）的转运蛋 白化合物的基因的方法将证实对于细胞工程化而言是有益的。
[0027] 通向本发明的开发工作发现，在Gallivan中公开的方法会产生显著水平的假阳 性结果，可能由于核糖开关是'泄露的'（甚至在没有茶碱存在下表达编码区）。
[0028] 因而，本发明的目标是，提供使用核糖开关调节机制进行生物催化剂和/或转运 蛋白化合物（和其基因）的体内选择的一般系统，其中所述系统是快速的、有成本效益的， 且可以以高通量模式使用，同时稳定地维持可忽略水平的假阳性结果。
【发明内容】
[0029] 本发明现在涉及生物催化剂和/或转运蛋白化合物（在本文中被统称为'一级调 节剂化合物'）的改进的体内选择程序，所述程序使用受效应物化合物在宿主细胞中的存在 控制的可调节的基因表达构建体，所述效应物化合物在宿主细胞中的存在依赖于所述一级 调节剂化合物的存在，其中所述一级调节剂化合物是能够调节所述效应物化合物的作用的 功能分子。包含本文描述的结合相同效应物化合物的两个或更多个核糖开关的多元调节性 选择系统的应用，会将假阳性结果的水平降低至可忽略的水平，同时维持对包含所述调节 性选择系统和所述一级调节剂化合物的宿主细胞的高选择性。
[0030] 在第一方面，本发明涉及包含核酸分子的可调节的基因表达构建体；
[0031] 其中所述核酸分子包含两个或更多个调节序列，每个所述调节序列编码包含对效 应物化合物做出应答的核糖开关的RNA分子，每个所述核糖开关可操作地连接到各个编码 区；
[0032] 其中每个编码区编码用于调节各个生长调节剂化合物的作用的各个调节剂化合 物；且
[0033] 其中将每个调节序列中的核糖开关选择成对相同效应物化合物做出应答以触发 它的各个调节剂化合物的表达。
[0034] 在本发明的一个优选实施方案中，所述可调节的基因表达构建体包含核酸分子， 所述核酸分子可以是、但不限于质粒、附加体DNA或染色体DNA。
[0035] 在本发明的一个优选实施方案中，所述可调节的基因表达构建体包含两个或更多 个核酸分子，其中每个核酸分子包含至少一个调节序列。
[0036] 在本发明的一个优选实施方案中，所述核糖开关可以是、但不限于天然存在的核 糖开关、嵌合的核糖开关、经工程改造的核糖开关、合成的核糖开关或重组的核糖开关。
[0037] 在另一个方面，本发明涉及在体内选择遗传编码序列的方法，所述遗传编码序列 编码至少一种调节效应物化合物的作用的一级调节剂化合物，所述方法包括：在有至少两 种生长调节剂化合物存在下培养宿主微生物的表达文库，每种生长调节剂化合物通常能够 阻止所述微生物的增殖，所述表达文库表达可能表达所述一级调节剂化合物的DNA片段的 文库；和在所述文库中选择增殖的微生物；
[0038] 其中所述一级调节剂化合物
[0039] -实现底物向所述效应物化合物的化学转化，且将所述底物提供给所述微生物； 或者
[0040] -将所述效应物化合物转运进所述微生物中，和
[0041] 其中所述宿主微生物包含可调节的基因表达构建体，所述可调节的基因表达构建 体包含核酸分子，所述核酸分子包含至少两个调节序列，每个所述调节序列编码包含可操 作地连接到各个编码区的核糖开关的RNA分子，其中每个核糖开关响应于所述效应物化合 物的存在而调节它的各个编码区的表达，且每个编码区编码各个二级调节剂化合物用于调 节各个所述生长调节剂化合物的作用，
[0042] 由此使所述文库中产生期望的一级调节剂化合物的微生物能够在有所述至少两 种生长调节剂化合物存在下增殖。
[0043] 在一个优选的实施方案中，所述宿主微生物的表达文库包含许多产生潜在一级调 节剂化合物群体的宿主细胞，其中所述许多宿主细胞：
[0044] -是单一细胞类型的细胞的文库，其中基本上每个宿主细胞包含编码至少一种潜 在一级调节剂化合物的克隆的核酸片段或突变的天然基因组；或者
[0045] -是不同细胞类型的细胞，其中基本上每个宿主细胞包含编码至少一种潜在一级 调节剂化合物的天然核酸片段。
[0046] 在另一个优选的实施方案中，在生长培养基中使所述宿主微生物与所述底物接 触，所述生长培养基包含至少两种抗生素化合物作为所述生长调节剂化合物，对每种抗生 素化合物的抗性在每个可操作地连接的编码区中编码，使得每个可操作地连接的编码区编 码一种抗生素化合物的抗性。优选地，所述编码区编码赋予