一种酪胺人工抗原和抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子化合物免疫化学和痕量残留分析技术领域；涉及有机合成，免 疫化学，生物化学及物化测试技术等；特别涉及生物胺类小分子化合物酪胺半抗原、人工抗 原的设计合成，和免疫动物特异性抗体的制备及其免疫分析方法的建立。
【背景技术】
[0002] 酪胺是存在于生物机体内的有效生理活性物质，是一种血管活性胺，在生物机体 的正常代谢中起着不可替代生理功能。微量的酪胺对大脑皮层及其精神活动具备重要的调 节作用，而且对血管和肌肉的松弛、收缩效果明显。另外，酪胺、苯乙胺等具有清除自由基、 抗氧化等作用，并可以抑制不饱和脂肪酸的氧化。通常情况下，人体摄入少量的酪胺不会对 人体产生影响，而当摄入过量的酪胺、组胺（尤其是同时摄入多种生物胺）时，会产生头痛、 恶心、心率加快、血压升高、呼吸急促等不良反应，严重的还会危害生命。酪胺还会引起外周 血管收缩，增加血糖的浓度，诱导去甲肾上腺素的分泌，引起患者血压升高以及偏头疼等。 EFSA指出，摄入酪胺、苯乙胺、色胺等，在其代谢消耗30min至数小时之后会引起血管收缩、 高血压，并伴有头痛、出汗、恶心、呕吐、瞳孔扩张等临床症状。正常情况下，可在24h逐渐恢 复。研究表明富含酪胺的食物可诱发偏头痛，摄食酪胺的含量如果超过l〇〇mg会导致血压 升高以及偏头痛，如果超过1080mg/kg会引发急性中毒性肿胀。
[0003] 酪胺广泛存在于肉类及其制品、水产品以及啤酒、酱油、奶酪等各类发酵食品中， 其含量水平常常作为新鲜度以及卫生状况的评定指标，因此很多国内外学者对酪胺的分离 检测方法进行了研究。常见的检测胺类物质的方法有色谱法、毛细管电泳法以及生物传感 器法等。传统仪器方法存在前处理复杂，仪器和相应配套费用昂贵，分析速度慢等缺点，难 以满足实际分析的需要，因此迫切要求发展简便、快速、灵敏的分析技术。
[0004] 但是与大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特点：
[0005] (1)小分子化合物lOOOdolton) -般不具有人工抗原性，不能直接免疫动 物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连 接构成接合物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原 与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方 式、载体种类、以及半抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构象、 极性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应抗体的性质，因此它们是决 定产生其特异性抗体和建立免疫分析方法的关键。
[0006] (2)虽然小分子化合物不具有人工抗原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发 生免疫学反应的能力，并可进行体外定量，遵循质量作用定律。
[0007] 免疫分析技术被引入小分子残留分折领域，成为一种最有发展和应用潜力的定量 分析技术之一，受到广泛的重视。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗 原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和 利用这些特性，是该领域重要的研究内容。这一技术目前已成为微量分析研究的一个崭新 领域，可与传统分析方法并列作为一项新的分析途径。酪胺人工抗原和特异性抗体以及以 此为基础建立免疫分析方法尚未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是通过设计合成酪胺半抗原及相应的人工抗原和抗体。本发明的另 一个目的是提供酪胺的半抗原及相应的人工抗原和抗体的制备方法。本发明再一个目的是 提供酪胺的半抗原及相应的人工抗原和抗体的应用。其中酪胺的人工抗原包括人工抗原和 包被原。
[0009] 本发明的独特之处在于突出了酪胺分子特异性抗原决定簇，又克服了化学合成的 困难，免疫动物诱导产生亲合性很高的特异性抗体；并以此为基础建立了 ELISA方法即快 速免疫分析方法，准确检测食品中的酪胺含量。
[0010] 本发明利用目标分析物半抗原与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物 制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量地检 测样本中超微量小分子目标分析物，即可用于样本测定。其选择性决定于免疫学反应的特 异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此可以快速准确地分析检测酪 胺在样本中的含量。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的 制备。
[0011] 人工抗原是合成半抗原与载体蛋白的偶联物，若用于免疫动物，即为人工抗原，若 用于免疫分析中包被反应板，即为包被原。对于同一种目标分子，人工抗原和包被原通常不 用同一种偶联物，目的是减少抗体对包被原的非特异性结合，提高分析的特异性和灵敏度。 因为人工抗原免疫动物所产生的抗体，不仅能识别半抗原，也能识别载体蛋白。因此，人工 抗原和包被原所用的载体蛋白一般是不相同的，载体蛋白的结构和分子质量差异越大，非 特异性结合反应越弱，分析灵敏度越高。另外人工抗原和包被原中半抗原结构有差异也有 利于提高方法灵敏度。本发明在人工抗原和包被原的制备中采用不同的方法为的是获得提 高方法灵敏度。
[0012] 为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0013] -种酪胺半抗原的分子结构如下所示：
[0015] -种酪胺人工抗原，是由酪胺半抗原与阳离子化的牛血清蛋白相连接合成，所述 酪胺人工抗原分子结构式为：
[0016]
[0017] -种酪胺包被原，是由酪胺半抗原与卵清蛋白相连接合成，所述酪胺包被原分子 结构式为：
[0019] -种酪胺抗体，是能与人工抗原或包被原发生特异性免疫反应的IgG抗体。
[0020] 酪胺人工抗原的制备方法采用甲醛法充分暴露酪胺所有抗原决定簇，包括以下步 骤：
[0021] (1)阳离子化BSA(cBSA)的制备：
[0022] 准确量取20mL PBS，冰浴下边搅拌边缓慢加入18. Omg乙二胺（EDA)，用lmol/LHCl 调pH至7. 4 ;称取1. 00g BSA和56. Omg EDC加入上述溶液中，室温反应2h ;用玻沙漏斗抽 滤，取上清液装入透析袋中；用0. 〇lmol/L的PBS于4°C连续透析3天，然后在-20°C下，用 真空冷冻机进行干燥，最后冻存于_20°C冰箱。
[0023] (2)酪胺与载体蛋白cBSA的连接：
[0024] 准确称取20.0 mgcBSA于25mL圆底烧瓶，加入4mL 0· 01mol/L的PBS将其溶解，准 确称取4. 2mg酪胺于5mL小棕瓶中，加入200 μ LDMS0将其溶解。将酪胺缓慢加入溶解的蛋 白中。加入5yL 37%的甲醛水溶液，30°C水浴磁力搅拌8h。反应液澄清，装入透析袋中， 用0· 01mol/L的PBS于4°C连续透析3天，然后分装，-20°C保存备用。
[0025] 酪胺包被原的制备方法采用戊二醛一步连接法，包括以下步骤：
[0026] 准确称取20.0 mg 0VA于25mL圆底烧瓶，加入4mL 0. 01M的PBS将其溶解，准确称 取4. 2mg酪胺于5mL小棕瓶中，加入200 μ L DMS0将其溶解。将酪胺缓慢加入溶解的0VA 中。缓慢加入15 yL 25%的戊二醛水溶液，4°C下磁力搅拌过夜。将反应液装入透析袋中， 用0· 01mol/L的PBS于4°C连续透析3天，然后分装，-20°C保存备用。
[0027] 酪胺抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0028] (1)免疫：免疫动物选用雌性大白兔，首次免疫采用背部多点皮下注射和腿部肌 肉注射免疫，加强免疫采用背部多点皮下注射免疫。初免后进行四次加强免疫，具体做法分 别是：
[0029] 初次免疫：取lmg上述人工抗原溶于0. 9 %的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所 配制的溶液中，进行动物免疫；
[0030] 加强免疫：用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体 积所配制的溶液，进行动物免疫；加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次， 此后间隔一个月。第五次免疫后9天时由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；
[0031] (2)抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对上述述的酪胺包被原效价达到 较高水平时，采集血液，并离心获得抗血清，使用ProteinA-Sepharose4B蛋白亲和层析柱 对抗血清进行纯化，制备得到上述的IgG抗体。
[0032] 所述的酪胺抗体应用于生物胺酪胺含量的免疫检测，所述的免疫检测为酶联免疫 吸附剂测定，即ELISA。
[0033] 酪胺抗体应用于生物胺酪胺含量的免疫检测，包括如下步骤：
[0034] (1)包被：用包被液把包被抗原适当稀释，然后以100 μ L/well包被于96孔酶标 板上，4°C孵育过夜或37°C孵育3h。
[0035] (2)洗板：加入洗涤液PBST，250 μ L/孔，于振荡器上振荡2min，弃去PBST，重复洗 板3次；
[0036] ⑶封闭：每孔加入200 μ L封闭液，于37°C封闭lh，然后弃去封闭液，用PBST重 复洗板3次；
[0037] (4)加样：每孔先加入50 μ L的酪胺标准溶液或样品溶液，然后各加入50 μ L的抗 体，加样完毕后，在37°C下竞争反应lh，然后用PBST重复洗板4次；
[0038] (5)加羊抗兔HRP标记二抗：把羊抗兔HRP标记二抗用PBS稀释适当浓度，100 μ L/ well加样，37°C下孵育30min，用PBST重复洗板5次。
[0039] (6)显色：每孔加入100 μ L混匀后的底物液，37°C下反应15-20min ;
[0040] (7)终止：每孔加入50 μ L的硫酸终止液，终止显色反应。
[0041] (8)读数：在双波长方式（450nm为测定波长，650nm为参比波长）下用酶标仪测定 各孔的吸光度值。抑制率的计算公式如式所示：
[0043] 式中：0D对照：加 PBS和抗体的微孔的吸光值；
[0044] 0D空白：只加 PBS的微孔的吸光值；
[0045] 本发明制备出酪胺的高灵敏度、特异性强的抗体，建立简单、快速的酪胺酶联免疫 检测方法，为食品新鲜度的检测提供了一种可靠的技术支撑。
[0046] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0047] (1)该设计、合成的人工抗原与目标待测物相似程度高，对待测物的特征结构保留 完整，充分暴露酪胺抗原决定簇，为制备特异性良好的抗体奠定了基础；采用不同合成方法 制备有结构差异的包被原，与抗体组成抗原抗体竞争反应系统，利用抗体识别差异化提高 方法灵敏度。
[0048] (2)其抗体具有良好的特异性和灵敏度，检测极限达到0· 02mg/L。
[0049] (3)因此，本发明合成人工抗原的方法与其他方法相比较，更加易于推广普及。并 且提供的快速检测方法操作简便、快速，而且检测的精确度可达90%以上，非常适合现场检 测的需要。因此，本发明不仅在实验室检测中表现出色，并为开发出成本低廉、检测效率高、 操作简便的酶联免疫快速检测工具，奠定了