一种高效价尿促性素的提取及纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域，具体而言，本发明涉及高效价尿促性素的提取及纯化方法。
【背景技术】
[0002]尿促性素(HMG)是由人脑下垂体前叶部分分泌的一种糖蛋白促性腺激素，一般是从绝经期或绝经期后妇女的尿液中经提取纯化而制得。妇女在行经期间HMG的含量有所波动，但较低，只有妇女进入绝经期或之后的十几年中，其尿中HMG的含量方达到高峰(60-100iu/L尿)，并能维持在一个稳定的水平上，HMG含有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)，其所含比例近似1:1。临床主要用于治疗妇女因功能性不排卵所致的不育症；男性因激素水平低下所引起的精子过少或活力不足。另外，还用于治疗诸如妇女闭经、月经不调、男女之性机能失调等症。
[0003]1928年Ascbheim首先报道了从更年期妇女尿液中发现了活性物质，之后报道虽不少，但真正对HMG的了解和制备，是从20世纪60年代的Donimi开始，并逐渐形成比较规范化的工艺来制备的。我国从20世纪70年代开始研究，80年代正式进入临床试验阶段，90年代开始大量生产。
[0004]目前，比较经典的制备工艺是高岭土 -乙醇法制备HMG粗制品，再用各种纯化方法进行纯化。国内目前常用的纯化方法收率偏低(一般小于50%)，成品效价在lOOiu/mg左右。中国专利CN101792482A介绍了 “一种促性腺激素的纯化方法”，该方法采用硅酸铝粉末作为吸附剂提取纯化HMG，但其效价仅能达到150iu/mg。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种高效价HMG的提取及纯化方法，与传统的分离纯化方法相比，此方法突破了吸附分离杂蛋白技术难点，使HMG效价可稳定达到500iu/mg以上。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现:
1、粗品提取
1.1吸附，按尿量:高岭土 =100:0.7比例投料。
[0007]取醋酸调尿液pH至3.8-4.8，加高岭土搅拌2小时，静置，离心取干吸附物。
[0008]1.2脱附，洗脱液配比为尿液:水:氨水=1000:14:1.5。
[0009]1.2.1在干吸附物中加洗脱液适量，调pH至10左右，搅拌2小时，离心取上清液。
[0010]1.2.2上清液用醋酸调PH5.5，加2倍量乙醇，搅拌均匀，静置沉淀，将沉淀物用五氧化二磷干燥，得粗品。
[0011]2.HMG中间体提取
2.1将粗品慢慢投入1:30比例的乙酸铵提取液中，在低温下搅拌2小时，离心取上清液。
[0012]2.2上清液加3倍量95%乙醇，搅拌2小时静置，离心弃去上清液。
[0013]2.3沉淀物加适量乙醇脱水，再离心弃去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG中间体
3.HMG精品提取 3.1协和工序 3.1.1吸附
将HMG中间体用100倍量醋酸钠缓冲液在低温下溶解，离心取上清液。上清液加10倍量协和树脂搅拌2小时，离心弃去上清液。树脂用醋酸钠缓冲液反复洗涤，至280nm0D值小于0.25为止。
[0014]3.1.2洗脱，洗脱液为10%乙酸铵-40%乙醇溶液
吸附好的树脂柱加5倍量洗脱液洗脱，流出液加4倍量95%乙醇，静置，离心取沉淀物。沉淀物用无水乙醇脱水，离心再取沉淀物，用五氧化二磷干燥即得协和干粉。
[0015]3.2 DEAE-Cellulose 柱层析工序 3.2.1 DEAE-Cellulose 树脂处理
3.2.1.1将柱中的DEAE-Cellulose树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静置，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，纯化水浸没静置。
[0016]3.2.1.2 将DEAE-Cellulose树脂滤干，用少量纯化水洗涤，滤干后，装入桶中，用0.5M HC1浸没，搅拌，过滤，用纯化水洗至中性，再分别用0.5M NaOH浸泡，搅拌，过滤，再用纯化水洗至中性。
[0017]3.2.1.3将树脂滤干，用0.05M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)反复平衡到pH7.5后，用缓冲液浸没，待用；
3.2.1.4将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用0.05M Tris-HCl (pH7.5)缓冲液走柱，以流出液的pH近7.5为标准。
[0018]3.2.2 上样
3.2.2.1将协和干粉按1:100倍比例溶解于0.05M Tris-HCl (pH7.5)缓冲液中搅拌溶解；
3.2.2.2 上样，流速控制在50-60ml/min。
[0019]3.2.3 洗涤
上样结束后，用0.05M Tris-HCl (pH7.5)缓冲液洗涤至流出液0D值在0.25以下，流速控制在60 ml/min左右。
[0020]3.2.4 洗脱
用0.2M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗脱，流速控制在70ml/min左右，洗脱至流出0D值在0.35以上，滴加乙醇变浑浊后，开始收集流出液，直到0D值在0.35以下，停止收集流出液。
[0021]3.2.5 沉淀
计量流出收集液体积，转入桶内，加入5倍量(V/V) 95%乙醇，搅拌均匀，然后静置。
[0022]3.2.6 干燥
3.2.6.1弃去桶内的上清液，沉淀物离心，弃去上清液；
3.2.6.2沉淀物用适量的无水乙醇脱水，离心弃去上清液，重复二次；
3.2.6.3最后，将沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG精品。
[0023]4.注射级HMG提取
4.1取精品HMG加入25倍量(ml)纯化水，搅拌溶解。
[0024]4.2溶解液加等体积乙醇，再加总体积8%的醋酸铵溶液，搅拌充分
4.3在不断搅拌下分别加入精品HMG12倍的0.2M磷酸钠溶液，纯品HMG12倍的0.3M
醋酸钙溶液。
[0025]4.4用5M氢氧化钠溶液调pH至8.5，搅拌2小时，离心取上清液。
[0026]4.5上清液用5M盐酸调pH至6.5-7.0，加10倍量95%乙醇，静置，离心弃去上清液，沉淀物用无水乙醇洗涤，再离心弃去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得注射级HMG。
[0027]本发明提供的提取及纯化方法获得的以FSH和LH为主要成分的尿促性素具有更高的效价，可达300iu/mg以上。
【具体实施方式】
[0028]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0029]实施例:
1、粗品提取 1.1吸附
采集绝经期妇女尿液1000kg，用醋酸调pH值，并用pH3.8-5.4精密试纸测定，调节尿液pH到3.8-4.8之间，加7kg高岭土，搅拌2小时，静置，离心取得干吸附物10kg。
[0030]1.2 脱附
1.2.1干吸附物加水14L，25%氨水6L溶解，继续加氨水调pH至10左右，搅拌2小时，
离心取上清液。
[0031]1.2.2上清液用醋酸调pH5.5，加2倍量乙醇，搅拌均匀，静置沉淀，将沉淀物用五氧化二磷干燥，得粗品40g。
[0032]2、HMG中间体提取
2.1将粗品慢慢投入1:30比例的2L乙酸铵提取液中，在低温下搅拌2小时，离心取上清液。
[0033]2.2上清液加95%乙醇6L，搅拌2小时静置，离心弃去上清液。
[0034]2.3沉淀物加适量乙醇脱水，再离心弃去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG中间体12g。
[0035]3、HMG精品提取
3.1协和工序
3.1.1吸附将HMG中间体用1.2L醋酸钠缓冲液在低温下溶解，离心取上清液。上清液加0.12kg协和树脂搅拌2小时，离心弃去上清液。树脂用醋酸钠缓冲液反复洗涤，至280nm0D值小于
0.25为止。
[0036]3.1.2洗脱，洗脱液为10%乙酸铵-40%乙醇溶液
吸附好的树脂柱加6kg洗脱液洗脱，流出液加24L95%乙醇，静置，离心取沉淀物。沉淀物用无水乙醇脱水，离心再取沉淀物，用五氧化二磷干燥即得协和干粉1.8g。
[0037]3.2 DEAE-Cellulose 柱层析工序 3.2.1 DEAE-Cellulose 树脂处理
3.2.1.1将柱中的DEAE-Cellulose树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静置，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，纯化水浸没静置。
[0038]3.2.1.2 将DEAE-Cellulose树脂滤干，用少量纯化水洗涤，滤干后，装入桶中，用0.5M HC1浸没，搅拌，过滤，用纯化水洗至中性，再分别用0.5M NaOH浸泡