抗egfr人源化单克隆抗体、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人源化抗EGFR单克隆抗体，以及编码所述抗EGFR单克隆抗体的 核酸分子。本发明还涉及所述抗EGFR单克隆抗体的制备方法，以及所述抗EGFR单克隆抗 体用于制备抗肿瘤药物的用途。
【背景技术】
[0002] EGFR是原癌基因 c-erbBl的表达产物，是表皮生长因子受体（HER)家族成员之一。 EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信 号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功 能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫 缺陷及心血管疾病的发生。因此，如果有药物能阻断EGFR的活性，那将会抑制其信号传导， 从而起到多重途经的抗肿瘤作用。
[0003] EGFR抑制剂主要包括单克隆抗体和一些小分子化合物。其中EGFR单克隆抗体是 与内源性配体竞争结合EGFR，通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作用产生抗肿 瘤效应。目前已上市的3种抗EGFR单克隆抗体与化疗药相比，这些抗体作用特异性更强， 副作用小，在临床上取得了很好的疗效。
[0004] Erbitux (爱必妥）是2004年二月美国FDA批准上市，用于治疗EGFR过度表达的 恶性结肠直肠癌，是百时美施贵宝和免疫克隆系统公司联合研制的，可与多种化疗药联合 应用，对晚期非小细胞肺癌（NSCLC)疗效显著。泰欣生（尼妥珠单抗注射液），是我国第一 个人源单克隆抗体药物，2006年4月被SFDA批准上市，适用于与放疗联合治疗表皮生长因 子受体（EGFR)表达阳性的III/IV期鼻咽癌。Vectibix(panitumumab、帕尼单抗）是第一个 完全人源化单克隆抗体，其靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR)。2005年7月，Vectibix 获得FDA快速通道审批资格。2005年底，安进公司及其合作伙伴Abgenix公司共同向FDA 提交了该生物制剂许可申请，用于治疗化疗失败后转移性结直肠癌。
[0005] 本领域仍需要进一步提高抗EGFR抗体的质量均一性，同时尽可能提高其活性，降 低其毒副作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是通过改造抗体的氨基酸序列和去除岩藻糖糖基化技术大大提高 抗EGFR抗体产品的质量均一性和减少可能的免疫毒副作用，同时增强抗体的ADCC (抗体依 赖的细胞毒性）活性。具体地，本发明包括以下几个方面：
[0007] 本发明第一方面涉及抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分，其轻链可变区的氨 基酸序列如SEQ ID NO :5所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示。
[0008] DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTQGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK(SEQ ID NO ：5)〇
[0009] EVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIffSGGNTDYNTPFTSRLSI NKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO ：6)〇
[0010] 在本发明的一个实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的重链 恒定区选自来源于人的IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
[0011] 在本发明的一个实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的重链 恒定区选自来源于人的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。
[0012] 在本发明的一个具体实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的 重链恒定区来源于人的IgGl。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链 恒定区为来源于人的κ或λ。
[0014] 在本发明的一个具体实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的 轻链恒定区来源于人的κ。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分为全抗 体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab'） 2或 Fv。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的岩藻 糖的含量占总含糖量的5%以下，例如2. 5%以下，例如1.8%以下。
[0019] 本发明还涉及核酸分子，其含有编码本发明第一方面任一项的抗EGFR单克隆抗 体或其抗原结合部分的序列。
[0020] 在本发明的一个实施方案中，所述核酸分子含有SEQ ID NO :7所不的序列，和/或 SEQ ID NO :8所示的序列。
[0021] gatatcctgctgacccagagccccgtgatcctgagcgtgagccccggcgagcgcgtgagcttctcct gccgcgccagccagagcatcggcaccaacatccactggtaccagcagcgcaccCAGggcagcccccgcctgctga tcaagtacgccagcgagagcatcagcggcatccccagccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgatttcaccc tgagcatcaacagcgtggagagcgaggacatcgccgattactactgccagcagaacaacaactggcccaccacct tcggcgccggcaccaagctcgagctgaag(SEQ ID NO ：7)
[0022] gaggtgcagctgaagcagagcggccccggcctggtgcagcccagccagagcctgagcatcacctgcacc gtgagcggcttcagcctgaccaactacggcgtgcactgggtgcgccagagccccggcaagggcctggagtggctggg cgtgatctggagcggcggcaacaccgattacaacacccccttcaccagccgcctgagcatcaacaaggataacagca agagccaggtgttcttcaagatgaacagcctgcagagcCaggataccgccatctactactgcgcccgcgccctgacc tactacgattacgagttcgcctactggggccagggcaccctggtcaccgtgagcgcc(SEQ ID NO ：8)
[0023] 在本发明的一个实施方案中，所述核酸分子含有SEQ ID NO :1所;^的序列，和/或 SEQ ID NO : 2所示的序列。
[0024] 本发明还涉及重组载体，其含有本发明任一项的核酸分子。
[0025] 在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述载体含有本发明任一项 所述的核酸分子，所述载体可以通过例如将上述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得 到，或者可以通过人工合成得到。
[0026] 在本发明中，所述表达载体例如为原核表达载体，真核表达载体，噬菌体载体或 病毒载体。其中所述原核表达载体例如为PET载体、PGEX载体，所述真核表达载体例如为 pcDNA3.1、pEGFP-Cl、pPIC9K，所述菌体载体例如为λ菌体载体λgt、λgt-λB，所述 病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。
[0027] 在本发明的一个实施方案中，所述载体为真核表达载体pTGS-FRT-DHFR。
[0028] 在本发明的一个实施方案中，将真核表达载体pTGS-FRT-DHFR做了进一步改造。 在本发明的一个实施方案中，所述改造方法为去除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成 酶表达盒子。在本发明的具体实施方案中，所述表达载体为载体GS。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，在所述真核表达载体pTGS-FRT-DHFR或载体GS中连 接SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列后，即得到重组载体。
[0030] 本发明还涉及重组细胞，其含有本发明任一项的重组载体。
[0031] 在本发明的一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为适 合表达抗体的细胞，例如为来源于人、鼠或猴的哺乳动物细胞。在本发明的具体实施方案 中，所述哺乳动物细胞为CHO细胞，例如为CHO - Kl细胞；
[0032] 在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物细胞对其表达的蛋白部分地、几乎完 全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能，例如通过完全或部分抑制岩藻糖修饰途径中相关 蛋白的功能来实现。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物细胞为岩藻糖修饰途径相 关基因敲除的细胞。
[0033] 在本发明的具体实施方案中，其中所述岩藻糖修饰途径相关基因为gft基因。
[0034] 在本发明的具体实施方案中，通过敲除哺乳动物细胞的gft基因获得了对其表 达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能的细胞；具体地，针对GFT 基因 SLC35cl 的序列（编号 GenBank:BAE16173. 1)优化设计了两个 GFT zinc-finger nuclease锌指酶序列G1F1、G2F2,进而达到基因敲除的目的。
[0035] 在本发明的具体实施方案中，所述对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全 地不具有岩藻糖修饰功能的哺乳动物细胞是经过目标培养基驯化后的细胞。
[0036] 在本发明的实施方案中，所述目标培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞 培养基。
[0037] 在本发明的实施方案中，所述目标培养基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培养基 干粉Maxgrow 202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES ;
[0038] 在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基的成分为Pluronic F-68 l.Og/L、 葡萄糖8. 8g/L、培养基干粉Maxgrow 202 7. 44g/L、碳酸氢钠 I. 98g/L、氯化钠 3. 47g/L和IM HEPES 15ml/L，并调节pH至7. 0±0.1。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基用于 细胞驯化和种子培养。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基为表1-1的种子培养 基。
[0039] 在本发明的实施方案中，所述驯化培养的方法为本领域所公知，例如先将细胞在 含有10%小牛血清的目标培养基中贴壁培养，按照50%的比例逐级去除血清，例如小牛血 清浓度从10%逐级降至5%、2. 5%、1. 25%、直至完全不含血清，然后继续传代数次，至宿 主细胞完全悬浮，成倍增长稳定，最终获得能够在目标培养基中生长的稳定宿主细胞。
[0040] 本发明还涉及组合物，其含有本发明任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合 部分、本发明任一项的核酸分子、本发明任一项的重组载体、或者本发明任一项的重组细 胞，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
[0041] 本发明还涉及本发明任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的制备方 法，其包括使用本发明任一项的核酸分子、本发明任一项的重组载体、或者本发明任一项的 重组细胞的步骤。
[0042] 在本发明的一个实施方案中，其具体包括以下步骤：
[0043] 1)将本发明任一项的核酸分子的核苷酸序列克隆入表达载体中，得到重组表达载 体；
[0044] 2)将重组表达载体转入宿主细胞，得到重组细胞；
[0045] 3)将步骤2)获得的重组细胞在目标培养基中进行培养，获得能够表达抗体的细 胞株；
[0046] 4)逐步放大培养步骤3)获得的细胞株，收获培养上清；
[0047] 5)将步骤4)获得的培养上清进行纯化获得本发明任一项的抗EGFR单克隆抗体或 其抗原结合部分。
[0048] 在本发明的一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为适 合表达抗体的细胞，例如为来源于人、鼠或猴的哺乳动物细胞。在本发明的具体实施方案 中，所述哺乳动物细胞为CHO细胞，例如为CHO - Kl细胞；
[0049] 在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物细胞对其表达的蛋白部分地、几乎完 全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能，例如通过完全或部分抑制岩藻糖修饰途径中相关 蛋白的功能来实现。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物细胞为岩藻糖修饰途径相 关基因敲除的细胞。
[0050] 在本发明的具体实施方案中，其中所述岩藻糖修饰途径相关基因为gft基因。
[0051] 在本发明的具体实施方案中，通过敲除哺乳动物细胞的gft基因获得了对其表 达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能的细胞；具体地，针对GFT 基因 SLC35cl 的序列（编号 GenBank:BAE16173. 1)优化设计了两个 GFT zinc-finger nuclease锌指酶序列G1F1、G2F2,进而达到基因敲除的目的。在本发明的具体实施方案中， 所述gft基因敲除的细胞为CH0K1-AF。
[0052] 在本发明的一个实施方案中，所述重组表达载体是在载体pTGS-FRT-DHFR的基础 上改造获得，优选地，所述改造是指去除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成酶表达盒 子。
[0053] 在本发明的实施方案中，所述重组表达载体是GS载体。
[0054] 在本发明中，所述目标培养基是适合哺乳动物细胞生长、适合抗体表达的培养基， 其为本领域所公知，优选为无血清培养基。在本发明的实施方案中，所述步骤3)中的目标 培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞培养基。
[0055] 在本发明的实施方案中，所述目标培养基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培养基 干粉Maxgrow 202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES ;
[0056] 在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基的成分为Pluronic F-68 l.Og/L、 葡萄糖8. 8g/L、培养基干粉Maxgrow 202 7. 44g/L、碳酸氢钠 I. 898g/L、氯化钠 3. 47g/L和 IM HEPES 15ml/L，并调节pH至7. 0±0.1。在本发明的具体实施方案中，所述目标