一种硫酸酯化灰树花水不溶性多糖及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品技术领域，涉及一种多糖及其制备方法，尤其是一种硫酸酯化灰树花水不溶性多糖及应用，该硫酸酯化灰树花水不溶性多糖能够增强免疫力。
【背景技术】
[0002]灰树花(Grifola frondosa)，又叫贝叶多孔菌、千佛菌等，原产于日本的东北部、北美等地，是一种珍贵的药食两用菌。由于灰树花培育方法简单且产量大，因此在全球范围内广泛分布，在全球应用最重要的菌类中，灰树花的产量位居第二位。
[0003]灰树花提取物D-fract1n拥有明显的抗肿瘤功能，此项成果于1987年在国际药物化学杂志《化学与药物公报》上首先报道；1992年，在难波弘障等几位日本科学家的研究下指出灰树花多糖可以抵御艾滋病毒；经过美国宾夕法尼亚大学化学系研究人员多年的研究发现，灰树花中的抗氧化物质-麦硫因作为细胞保护剂可以预防强致癌物引起的肿瘤和基因突变；2009年，美国Albert Hecks教授最新的研究成果显示，他们成功地从日本舞茸样品中提取出一种具有识别基因错误作用的生物酶，这种酶能够有效抑制肿瘤生成。
[0004]硫酸酯化多糖(Sulfated Polysaccharides, SPS)，也称多糖硫酸酯(PolysaccharideSulfate，PSS)，是指糖基上含有硫酸基团的多糖，其来源主要分为二类:一是从动物、植物、微生物中直接提取的多糖硫酸酯，如有天然抗凝剂之称的肝素以及酸性粘多糖类的硫酸软骨素。近年来，从藻类中提取的天然褐藻多糖硫酸酯显示出了较好的抗氧化活性；来源于海藻的角叉菜胶作为天然多糖硫酸酯，具有卓越的抗HIV活性。
[0005]多糖的功能和活性取决于其平面及空间结构和其理化性质。硫酸基团的引入而产生的聚阴离子特性是多糖硫酸酯化后具有的新特性，这种特性有利于提高多糖的溶解性，糖链的屈伸性也得到了改善。硫酸基团之间以及硫酸基团与糖链间的的静电排斥和空间位阻，致使糖环构象发生转变和扭曲，改变了多糖的结构，进一步促使多糖获得新的生物活性。部分多糖经硫酸酯化后增加了其生物活性，一些改性前不具备的活性在改性后表现显著。还有一些多糖经硫酸酯化后，其原有活性得到增强，具备更好的活性与功效。硫酸酯化多糖具有免疫调节、抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性。
[0006]作为自然界含量最丰富的生物大分子之一，多糖与人类生活密切相关。灰树花多糖作为多糖家族中的重要一员，因其广泛的来源、便捷的使用、较高的安全系数、显著的生物活性，已获得国内外人士的广泛认可。人们对于灰树花子实体多糖的研究多将重点放在灰树花水溶性多糖，而较少被关注的水不溶多糖占据了灰树花子实体多糖的较大比例，其提取方法也较不成熟，同时其应用方面也较窄。而且，对多糖进行硫酸酯化修饰需选择适宜的酯化剂，再经一定的溶剂系统作为多糖的酯化环境，在一定的反应条件下，多糖的部分羟基即可被硫酸基团取代，现有的氯磺酸-吡啶法酯化剂合成繁琐，反应过程中有腐蚀性气体产生，不宜大规模生产；三氧化硫吡啶法生产的产物粘稠、不易搅拌，反应进行迟缓，产物得率低且性状不均一。
[0007]本发明研究了灰树花子实体中提取的水不溶多糖的硫酸酯化方法与条件，获得的硫酸酯化多糖具备良好的水溶性和显著的免疫调节活性，使灰树花水不溶多糖得到了充分的利用。
[0008]通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种硫酸酯化灰树花水不溶性多糖及应用，该硫酸酯化灰树花水不溶性多糖能够增强免疫力，其能够应用在药物或保健品中Ο
[0010]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0011]—种硫酸酯化灰树花水不溶性多糖，制备方法的步骤如下:
[0012]⑴以灰树花多糖为原料，将灰树花多糖用Ν，Ν- 二甲基甲酰胺溶胀，所述灰树花多糖与Ν，Ν- 二甲基甲酰胺的比例mg:mL为200-300:l_5mL，然后加入[(CH3)3N *S03]，所述灰树花多糖与[(CH3)3N.S03]的质量比为400-600:1-4，水浴50_90°C搅拌反应5_7h，得反应产物；
[0013]⑵将反应产物冷却至室温，3000-5000r/min离心弃上清，沉淀加入无水乙醇后3000-5000r/min离心8_15min，用乙醇离心洗涤多糖3次，直到[(CH3) 3N.S03]的鱼腥味消除，得多糖沉淀物；
[0014]⑶将获得的多糖沉淀物溶于蒸馏水中，用NaOH溶液调pH至7，4000r/min离心20min，得上清液；
[0015]⑷将离心后得到的上清液装入透析袋，流水透析l-3d、蒸馏水透析0.5-1.5d，袋内透析液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75?80%，室温下静置10?12小时；在3000?5000转/分钟的转速下离心4?6分钟，收集沉淀，在40?55°C，0.07?0.09MPa的条件下干燥18?20小时，得硫酸酯化灰树花水不溶性多糖。
[0016]而且，所述步骤⑶中，所述灰树花多糖与蒸馏水的比例mg:mL为40-60:3_7。
[0017]而且，所述步骤⑴中将500mg灰树花多糖用6mL DMF溶胀，加入
2.5g [ (CH3) 3N.S03]，水浴 80 °C 搅拌反应 6h ;
[0018]或者，所述步骤⑵中沉淀加入无水乙醇后4000r/min离心lOmin ；
[0019]或者，所述步骤⑶中将获得的多糖沉淀物溶于50ml蒸馏水中，用NaOH溶液调pH至7，4000r/min离心20min，流水透析2d、蒸馈水透析Id ；
[0020]或者，所述步骤⑷中袋内透析液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80 %，室温下静置11小时，在4000转/分钟的转速下离心5分钟，收集沉淀，在50°C，0.08MPa的条件下干燥19小时，得产物硫酸酯化灰树花水不溶性多糖。
[0021]而且，所述步骤⑴中灰树花多糖的制备方法，步骤如下:
[0022]—、灰树花水不溶多糖的提取
[0023]灰树花子实体磨粉，过30目筛，粉末在体积百分数为95%的乙醇中80°C回流3h以除去脂类成分，重复操作1次，离心，得脱脂样品，脱脂样品经40°C真空干燥后用80°C蒸馏水回流提取三次，再用1.5mol/L NaOH于4°C过夜提取2次，料液比g:L为1:10，混合液4000r/min离心20min，上清液用冰醋酸调PH到7，离心收集沉淀，经水、丙酮、乙醚依次洗涤，冷冻干燥得到碱溶性灰树花粗多糖；
[0024]二、灰树花水不溶多糖的除杂
[0025]将干燥得到的粗多糖用1.5mol/LNa0H复溶，以除蛋白及碱不溶杂质，料液比比g:L为1:100，4000r/min离心20min后取上清液稀释至NaOH浓度为0.75mol/L，经冰醋酸中和、离心，沉淀用水充分洗涤后冷冻干燥，得除杂后的灰树花水不溶多糖；
[0026]三、灰树花水不溶多糖的分离纯化
[0027]①预处理:将所有的材料和试剂达到室温，上样缓冲液及流动相为0.25mol/L的NaOH溶液；选用idl.6 X 60cm层析柱，根据柱子大小取所需量的Sepharose CL-6B凝胶，清洗掉20%乙醇，脱气，用缓冲液配成匀浆；
[0028]②装柱:装柱前保证柱子底端存有一段缓冲液且无气泡，将凝胶匀浆经玻璃棒引流转移至柱内，同时避免产生气泡，调整出液口流速，使凝胶在柱内自由沉降；
[0029]③平衡:连结好柱头，打开蠕动栗，让缓冲液以固定流速流过柱子，使柱床稳定，到流出液电导和pH不变；
[0030]④样品制备及组分分离:将除杂后的灰树花水不溶多糖用0.25mol/L的NaOH溶液