一种透明质酸的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明公开了一种透明质酸的制备方法，属于透明质酸制备技术领域。
【背景技术】
[0002]透明质酸，又名玻璃酸，是一种线性阴离子聚合物。它是由双糖的单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中，在眼睛玻璃体、脐带、皮肤、软骨和滑液中含量较高。HA具有高保湿性、粘弹性和生物相容性等许多优良性质，以及与细胞表面特异受体专一性结合等优点，是一种理想的护肤养颜、智能药物释放及组织工程材料和医用敷料，目前被广泛应用于生物医学、组织工程及高级化妆品等领域。
[0003]目前，透明质酸的生产过程和技术决定了质量优劣的差异，所以在使用上一定要正确来源生产的产品才有治疗的功效，一般而言，提炼的生产方法有以动物组织为原料的提取法、微生物发酵法以及化学合成法。
[0004](1)动物组织:主要原料是鸡冠和牛眼玻璃体等，用丙酮或乙醇将原料脱脂、脱水，用蒸馏水浸泡，过滤，然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理，之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液，最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸，这种方法提取率极低，仅有1%左右，分离过程复杂，致使透明质酸价格昂贵，达5000美元/公斤，限制了在化妆品中的大量使用；
(2)微生物发酵:以葡萄糖作为碳源发酵液，在培养基中发酵48h，发酵结束后，过滤去除菌丝体和杂质，然后用醇沉淀法等简单操作即可得到高纯度的产物，采用发酵法制造透明质酸，关键在于菌种的选择；
(3)化学合成:采用天然酶聚合反应，首先使用多糖类聚合物合成“透明质酸氧氮杂环戊烯衍生物”，然后添加水分解酶，制造出衍生物和酶的复合体，最后在高温反应液中清除其中的酶，就合成了透明质酸，采用人工合成法可以大大降低透明质酸的制造成本，但结果较不精纯。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统的透明质酸在提炼生产过程中，常常采用动物组织为原料，导致分离过程复杂、透明质酸价格昂贵、无法在化妆品中大量使用，以及提取率极低的问题，提供了一种以牛眼、鸡冠为原材料，通过加入鸡血进行焙炒预处理，然后将焙炒后的物质分两部分，一部分作为发酵物，另一部份作为霉菌培养液进行自身霉菌培养，随后收集霉菌，通过乙醇提取，以及氯化钠水溶液处理，并加入胰蛋白酶保温后得到混合液，最后用离子交换剂进行处理、纯化得到透明质酸的制备方法。该方法原料简单易得，不仅降低了生产成本，使得透明质酸可以大规模使用，而且分离过程简单易行，使得透明质酸的提取率得到了显著的提高。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是: (1)取50?80g牛眼、70?90g鸡冠，放入清水中，反复搓洗1?3次，去除内部血块以及表面污物后，放入绞碎机中，绞碎5?lOmin，得绞碎混合物；
(2)选择当天宰杀的300?350mL新鲜鸡血，向其中加入15?18mL质量浓度为25%的柠檬酸，搅拌均匀，静置1?2min后，去除表面已凝结的血块，并将剩余的鸡血置于紫光灯下灭菌处理20?25min，待灭菌结束，再向其中加入上述步骤中得到的绞碎混合物，混合均匀后，移入锅中进行焙炒，设置焙炒温度为85?120°C，焙炒时间为10?12min，待焙炒结束，取焙炒后混合物质量的60%置于发酵罐中，并向其中加入200?250mL温开水，充分搅拌均匀；
(3)取1?3个新鲜白萝卜放入水池中，刷洗表面污物后，捞出沥干，之后用刀将每个萝卜切成四半，挖去中间的萝卜心，置于坛子中，加入萝卜质量2?3倍的清水和0.2?0.4倍质量浓度为75%的氯化钠溶液，充分搅拌均匀，密封浸泡8?10天，待浸泡完毕，取出萝卜，得酸萝卜水；
(4)将上述得到的酸萝卜水也倒入上述步骤(2)装有焙炒混合物的发酵罐中，充分混合均匀后，密封发酵罐，并将发酵罐置于大缸中，之后向大缸中引入清水，直至完全浸没发酵罐为止，发酵期间，保证发酵温度为38?55°C，发酵时间为15?30天，待发酵完成后，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物置于离心机中，以1200?1500r/min转速离心处理15?22min，去渣，得发酵混合液；
(5)取上述步骤(2)中焙炒后混合物质量的40%置于容器中，用纱布遮盖，设置温度为20?25°C，空气相对湿度为65?70%，直至焙炒后混合物变质产生霉菌时，选取上述步骤得到的发酵混合液，调节pH值为5.2?5.8，每隔3?4h对霉菌进行一次淋洗，直至霉菌长出5?8cm白白的菌丝；
(6)用去离子水冲洗上述长出白白菌丝的焙炒混合物表面3?5次，收集冲洗后的去离子水，得菌丝悬浮液；
(7)取100?120mL上述得到的菌丝悬浮液倒入lOOOmL烧杯中，并向其中加入200?300mL质量浓度为60%的乙醇溶液，放置于磁力搅拌机上，以300?400r/min的转速搅拌20?30min，待搅拌完成后，再向其中加入100?150mL质量浓度为70%的氯化钠溶液，继续搅拌10?15min，得混合液；
(8)向上述得到的混合液加入1?2g胰蛋白酶，放入水浴锅中，加热升温至30?40°C，保温反应2?3h，之后将反应后的混合液放入旋转蒸发器中，升温至60?70°C，旋蒸去除乙醇，得到纯化后的透明质酸。
[0007]本发明的应用方法是:取本发明制得的2?4mL透明质酸放入60?80mL化妆品原液中，充分混合，密封保存，在每天早晚洁面后，取2?4mL涂抹在脸上各个部位，轻轻拍打直至完全吸收为止，长期使用，测得加入了透明质酸的化妆品比没有加入透明质酸的化妆品保湿程度高78%以上，且延缓衰老，对于皮肤没有任何危害。
[0008]本发明的有益效果是:
(1)原料简单易得，降低了生产成本，使得透明质酸可以大规模使用；
(2)制成的透明质酸活性高、热稳定性和pH稳定性好，且制备过程简单易行，使得透明质酸的提取率得到了显著的提高。
【具体实施方式】
[0009]首先取50?80g牛眼、70?90g鸡冠，放入清水中，反复搓洗1?3次，去除内部血块以及表面污物后，放入绞碎机中，绞碎5?lOmin，得绞碎混合物；然后选择当天宰杀的300?350mL新鲜鸡血，向其中加入15?18mL质量浓度为25%的柠檬酸，搅拌均匀，静置1?2min后，去除表面已凝结的血块，并将剩余的鸡血置于紫光灯下灭菌处理20?25min，待灭菌结束，再向其中加入上述步骤中得到的绞碎混合物，混合均匀后，移入锅中进行焙炒，设置焙炒温度为85?120°C，焙炒时间为10?12min，待焙炒结束，取焙炒后混合物质量的60%置于发酵罐中，并向其中加入200?250mL温开水，充分搅拌均匀；随后取1?3个新鲜白萝卜放入水池中，刷洗表面污物后，捞出沥干，之后用刀将每个萝卜切成四半，挖去中间的萝卜心，置于坛子中，加入萝卜质量2?3倍的清水和0.2?0.4倍质量浓度为75%的氯化钠溶液，充分搅拌均匀，密封浸泡8?10天，待浸泡完毕，取出萝卜，得酸萝卜水；接下来将上述得到的酸萝卜水也倒入上述装有焙炒混合物的发酵罐中，充分混合均匀后，密封发酵罐，并将发酵罐置于大缸中，之后向大缸中引入清水，直至完全浸没发酵罐为止，发酵期间，保证发酵温度为38?55°C，发酵时间为15?30天，待发酵完成后，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物置于离心机中，以1200?1500r/min转速离心处理15?22min，去渣，得发酵混合液；再取上述焙炒后混合物质量的40 %置于容器中，用纱布遮盖，设置温度为20?25°C，空气相对湿度为65?70%，直至焙炒后混合物变质产生霉菌时，选取上述步骤得到的发酵混合液，调节pH值为5.2?5.8，每隔3?4h对霉菌进行一次淋洗，直至霉菌长出5?8cm白白的菌丝；之后用去离子水冲洗上述长出白白菌丝的焙炒混合物表面3?5次，收集冲洗后的去离子水，得菌丝悬浮液；随后取100?120mL上述得到的菌丝悬浮液倒入lOOOmL烧杯中，并向其中加入200?300mL质量浓度为60%的乙醇溶液，放置于磁力搅拌机上，以300?400r/min的转速搅拌20?30min，待搅拌完成后，再向其中加入100?150mL质量浓度为70%的氯化钠溶液，继续搅拌10?15min，得混合液；最后向上述得到的混合液加入1?2g胰蛋白酶，放入水浴锅中，加热升温至30?40°C，保温反应2?3h，之后将反应后的混合液放入旋转蒸发器中，升温至60?70°C，旋蒸去除乙醇，得到纯化后的透明质酸。
[0010]实例1
首先取50g牛眼、70g鸡冠，放入清水中，反复搓洗1次，去除内部血块以及表面污物后，放入绞碎机中，绞碎5min，得绞碎混合物；然后选择当天宰杀的300mL新鲜鸡血，向其中加入15mL质量浓度为25%的柠檬酸，搅拌均匀，静置lmin后，去除表面已凝结的血块，并将剩余的鸡血置于紫光灯下灭菌处理20min，待灭菌结束，再向其中加入上述步骤中得到的绞碎混合物，混合均匀后，移入锅中进行焙炒，设置焙炒温度为85°C，焙炒时间为lOmin，待焙炒结束，取焙炒后混合物质量的60%置于发酵罐中，并向其中加入200mL温开水，充分搅拌均匀；随后取1个新鲜白萝卜放入水池中，刷洗表面污物后，捞出沥干，之后用刀将每个萝卜切成四半，挖去中间的萝卜心，置于坛子中，加入萝卜质量2倍的清水和0.2倍质量浓度为75%的氯化钠溶液，充分搅拌均匀，密封浸泡8天，待浸泡完毕，取出萝卜，得酸萝卜水；接下来将上述得到的酸萝卜水也倒入上述装有焙炒混合物的发酵罐中，充分混合均匀后，密封发酵罐，并将发酵罐置于大缸中，之后向大缸中引入清水，直至完全浸没发酵罐为止，发酵期间，保证发酵温度为38°C，发酵时间为15天，待发酵完成后，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物置于离心机中，以1200r/min转速离心处理15min，去渣，得发酵混合液；再取上述焙炒后混合物质量的40%置于容器中，用纱布遮盖，设置温度为20°C，空气相对湿度为65 %，直至焙