一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种干细胞复苏方法，特别是一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法。
【背景技术】
[0002]骨髓间充质干细胞是构建组织工程化骨重要的种子细胞，实现骨髓间充质干细胞的深低温保存对骨组织工程具有重要的意义。玻璃化冻存是使细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速率过冷到其玻璃化转变温度，而被固化为完全的玻璃态并以这种玻璃态在低温下长期保存的方法，在这一过程中细胞内外完全避免了结晶，从而得以避免由于结冰而引起的各种损伤。程序化冻存的复苏率只有5%~10%，而玻璃化冻存的复苏率>75%，因此玻璃化冻存是目前保存早期干细胞的重要方法。
[0003]但是玻璃化冻存存在着局限性。现有技术中玻璃化冻存剂通常采用DMS0，DMS0存在细胞毒性，从而引起细胞毒性损伤；复苏过程中还有可能引起保护剂的渗透性损伤，同时形成冰晶引起机械损伤，这些损伤都会大大降低冻存细胞的复苏率。
【发明内容】
[0004]本发明的发明目的在于:针对上述存在的问题，提供一种对骨髓间充质干细胞低细胞毒性，在玻璃化冻存复苏过程中低细胞毒性损伤，低渗透性损伤，提高冻存细胞复苏率的高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法。
[0005]本发明采用的技术方案如下:
本发明的一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法，包括以下步骤:
步骤一:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
由于采用了上述技术方案，LNG的温度略高于液氮，为-162°C，在LNG中经过预升温，能够略微提高冻存液的温度，为后面的迅速升温过程中避免出现小冰晶，对干细胞造成机械损伤提供了保障，提高了冻存干细胞的复苏率。
[0006]步骤二:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ;
由于采用了上述技术方案，温度在3.9°C的条件下DMS0对细胞毒性最小，但是温度过低，冻存液中可能形成小冰晶，从而对细胞造成机械损伤，因此将温度控制在3.2-3.9°C。
[0007]在真空状态下，阻隔空气热交换，提高升温效率，能够迅速升温，从而避免在升温过程中出现小冰晶，减小机械损伤，使得包含干细胞的冷冻成玻璃体液的冷冻液直接溶解成液体，提高复苏率。
[0008]步骤三:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，
0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ; 由于采用了上述技术方案，细胞生长因子给为干细胞的分裂生长提供催化激素，从而提高复苏率。
[0009]血清白蛋白及氨基酸等模拟人体环境，为干细胞复苏后提供一个适宜的环境，冲淡保护剂中的成分对干细胞的影响。
[0010]单糖为干细胞生长代谢提供养料，同时减小保护剂和复苏液的渗透压，减小在复苏过程中对干细胞造成的渗透损伤。
[0011 ] 羟乙基哌嗪乙硫磺酸是pH缓冲剂，能够保证体系的pH恒定，同时羟乙基哌嗪乙硫磺酸无细胞毒性，对干细胞不会造成细胞毒性损伤。
[0012]步骤四:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0013]冻存的克隆团块限制了克隆内部细胞暴露于复苏液，在次声波振荡条件下，可以将复苏液迅速扩散开，深入克隆内部细胞，从而将克隆团块内部的细胞也暴露在复苏液中。
[0014]本发明的一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法，所述次声波的频率为8~13Hzo
[0015]由于采用了上述技术方案，该频率与人体器官震动频率相接近，从而使得干细胞更好的适应冻存液环境，提高复苏液渗透效果。
[0016]本发明的一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法，所述细胞生长因子为表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。
[0017]由于采用了上述技术方案，表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子能够促进干细胞分化生长。
[0018]本发明的一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法，所述表皮生长因子的浓度为50~75Pg/L，所述酸性成纤维细胞生长因子的浓度为15~2(^g/L，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15~2(^g/L，所述血管内皮生长因子的浓度为4~6Pg/L。
[0019]由于采用了上述技术方案，浓度在上述范围内为适宜的范围，不会因激素含量过高导致细胞过快生长。
[0020]本发明的一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法，所述单糖为二羟基丙酮和L-甘油醛的混合溶液。
[0021]本发明的一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法，所述单糖包括
0.3%~0.5%的二羟基丙酮和0.5%~0.7%的L-甘油醛。
[0022]综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:
1、减小了在复苏过程中保护剂及复苏液对冻存细胞造成的细胞毒性损伤，为干细胞的分裂生长提供催化激素，同时为干细胞复苏创造了适宜的环境，整体上提高了冻存的复苏率。
[0023]2、采用次声波振荡条件，将复苏液迅速扩散开，深入克隆内部细胞，从而将克隆团块内部的细胞也暴露在复苏液中，增大了复苏液与干细胞的接触面积，提高了冻存细胞的复苏率。
【附图说明】
[0024]图1为未冻存细胞和冻存后复苏细胞显微镜观测图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图，对本发明作详细的说明。
[0026]为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]实施例1
如图1所示，一种高复苏率的冻存骨髓间充质干细胞复苏方法，包括以下步骤:
步骤一:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤二:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2°C ;
步骤三:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2°C的条件下，在次声波振荡(频率为8Hz )条件下加入20%的人血清白蛋白，20%的人血清白蛋白，0.8%的单糖，0.21%的细胞生长因子，0.8%的非必需氨基酸，0.08%的L-谷氨酰胺，0.03%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30s ;
步骤四:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0028]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0029]实验方法:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代。
[0030]步骤二:将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存24h。
[0031]取出冻存液按前述复苏方法进行复苏培养。
[0032]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培