一种具有转酯活性的脂肪酶Lip-1及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有转酯活性的脂肪酶Lip-ι及其编码 基因与应用。
【背景技术】
[0002] 随着社会的进步，对燃料的需求量越来越大。由于地球上石油储量的减少和环境 污染问题增加，生物柴油作为一种可再生的清洁能源，是化石燃料的理想代替燃料。酶催化 法生产生物柴油具有设备要求简单、反应条件温和以及环境污染小等优点，因此脂肪酶介 导的转酯反应生产生物柴油越来越受到关注。
[0003] 脂肪酶为脂肪酸三酰甘油酰基水解酶，能够催化水解甘油三酯、甘油二酯和甘油 一酯生成脂肪酸和甘油。脂肪酶在热力学有利的条件下（如低水含量）可以催化合成反应 如酯化和转酯反应。脂肪酶催化三酰甘油和低元醇反应生成甘油和脂肪酸甲酯，即生物柴 油。由于其催化的化学反应具有位点选择性，化学选择性及底物专一性而且副反应少等特 点而被广泛应用于去污剂，食品加工，有机合成，化妆品及医药等多种工业领域。
[0004] 目前许多微生物（包括细菌、酵母及真菌）被认为是胞外脂肪酶的潜在生产菌株。 尽管在高等植物及动物体内也存在脂肪酶，但是由于微生物脂肪酶基因资源丰富，酶稳定 性好及广泛的底物特异性等特点而受到工业生产者的青睐。此外，油体固定化技术利用了 油体蛋白两端亲水，中间强疏水的特性，由单层磷脂分子层包裹TAG，油体蛋白融合表达的 目的蛋白通过油体蛋白的挂接效应固定并展示到油体的表面，从而实现了脂肪酶一步纯化 和固定化，油体固定化脂肪酶将更有利于生物柴油的生产。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
[0006] 本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
[0007] a)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
[0008] b)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
[0009] c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的且与降解卤素化合物相关的蛋白质；
[0010] d)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的且与降解卤素化合物相关的蛋白质。
[0011] 本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
[0012] 本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述Bl)-B5)中的任一种：
[0013] BI)编码上述蛋白质的核酸分子；
[0014] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0015] B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0016] B4)含有BI)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3) 所述重组载体的重组菌；
[0017] B5)含有BI)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3) 所述重组载体的细胞系。
[0018] 上述相关生物材料中，BI)所述核酸分子的为如下1)或2)或3)或4)的DNA分 子：
[0019] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] 2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
[0021] 3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 % 或至少具有99 %同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0022] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA 分子。
[0023] 本发明还有一个目的是提供上述蛋白质的新用途。
[0024] 本发明提供了上述蛋白质作为脂肪酶中的应用。
[0025] 本发明还提供了上述蛋白质在催化低元醇和动植物油脂进行转酯反应中的应用。
[0026] 上述应用中，所述低元醇为甲醇，所述动植物油脂为橄榄油。
[0027] 上述蛋白质或上述相关生物材料在制备生物柴油中的应用也属于本发明的保护 范围。
[0028] 本发明的最后一个目的是提供一种生物柴油的制备方法。
[0029] 本发明提供的生物柴油的制备方法包括如下步骤：将上述蛋白质、醇、动植物油 月旨、有机溶剂和水混匀，得到混合体系，反应，得到生物柴油。
[0030] 上述方法中，所述水在所述混合体系中的质量分数为1-6%。
[0031] 上述方法中，
[0032] 所述有机溶剂为正己烷；
[0033] 所述醇为甲醇；
[0034] 所述动植物油脂为橄榄油。
[0035] 本发明通过构建元基因组文库和活性筛选自云南洱源牛街热泉中分离到一个新 的脂肪酶基因 Lip-Ι，并且将该脂肪酶与芝麻的油体蛋白融合表达，通过体外人造油体重构 实现了一步纯化和固定化脂肪酶Lip-Ι，并进行转酯反应。通过GC-MS测定表明，该脂肪酶 具有良好的转酯活性以及有机溶剂和甲醇耐受性，可以有效的应用于生物柴油的生产。
【附图说明】
[0036] 图1为pET32a-sole_Lip-l载体的构建示意图。
[0037] 图2为脂肪酶Lip-I与油体蛋白oleosin融合蛋白表达SDS-PAGE图。其中， M:Unstained Protein Mff Marker ;l:pET32a_空载IPTG诱导（上清）；2:pET32a_空载IPTG 诱导（沉淀）；3:pET32a-sole-Lip-lIPTG 未诱导（上清）；4:pET32a-sole-Lip-lIPTG 未诱 导（沉淀）；5:pET32a-sole-Lip-lIPTG诱导（上清）； 6:pET32a-sole-Lip-lIPTG诱导（沉 淀）。
[0038] 图3为脂肪酶转酯酶活GC-MS定性TIC峰图结果。其中，A:标样；B:空白； C:pET32a-sole-Lip-l 转酯酶活结果。
[0039] 图4为脂肪酶Lip-I有机溶剂耐受性结果图。其中，1:正己烷；2:叔丁醇；3:石 油醚；4:叔戊醇；5:正己烷：叔戊醇（4:1) ;6:正己烷：叔丁醇（4:1)。
[0040] 图5为脂肪酶Lip-I甲醇耐受性结果图。其中，横坐标代表反应体系中甲醇的终 浓度。
[0041] 图6为脂肪酶Lip-I含水量耐受性结果图。
【具体实施方式】
[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] 实施例1、Lip-I基因的获得
[0045] -、热泉BAC文库构建和脂肪酶活性克隆的筛选
[0046] 1、云南洱源牛街热泉微生物总基因组DNA的提取和纯化
[0047] (1)样品采集
[0048] 样品（云南洱源牛街热泉微生物）采自云南洱源牛街热泉（北炜26. 604(V，东 经99. 564V )。热泉水温58°C，pH为7. 0,富含钙、氟。用20 μπι的尼龙网粗过滤热泉水 样，使用Millipore公司的0. 22 μm的膜包浓缩后，置于无菌离心管，密封，4°C运回实验室 后-80°C保存。
[0049] (2)样品的处理
[0050] 从-80°C冰箱取出IOOmL浓缩水样，室温解冻，经150Xg离心，去除沉渣，上清 12000 X g离心，用灭菌的热泉水洗涤数次，直到颜色发白为止。用灭菌的热泉水悬浮沉淀， 得到细胞悬浮液，使得细胞的浓度为每毫升IO 7-IO8个。
[0051] (3)高分子量总基因组DNA的提取
[0052] 将细胞悬浮液与等体积的1.6%低熔点琼脂糖（SeaPlaque LMP agar〇se(FMC)) 于45°C混匀，立即加入可制成胶块的模具（Bio-Rad)中，4°C凝固30分钟，取出胶块，置于5 倍体积的裂解液（IOmM Tris [pH 8. 0]，50mM NaCl, 0· IM EDTA, 1% Sarkosyl, 0· 2% sodium deoxycholate，lmg of lysozyme per ml)中 37°C裂解 lh，然后把胶块转到 ESP buffer(l% Sarkosyl - Img of proteinase K per ml in 0· 5M EDTA)中，50°C裂解48h，其间更换一次 ESP buffer。
[0053] (4)高分子量总基因组DNA纯化
[0054] 用10-20倍体积的冰冷TE含0.1 mM PMSF冰上洗涤包埋块，共3次每次lh。然后 用10-20倍体积的冰冷TE冰上洗涤包埋块3次每次lh。此时，凝胶块中包含纯化的高分子 量的总基因组DNA。将包埋块保存于0. 05M EDTA(pH8. 0)中，4°C可放置1年，DNA无明显降 解。
[0055] 2、高分子量的总基因组DNA的酶切与回收
[0056] 将纯化后