一种含有抗虫基因的重组dna片段及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种含有抗虫基因的重组DNA片段及其应用，特别涉及一种根据玉米 偏好密码子设计并合成的含有抗虫基因的重组DNA片段及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物， 由于原核生物基因自身的特点，如DAT含量较高，超过60%，造成基因表达的mRNA在植物 体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、 mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结 构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5' -UTR序列和3'末端的polyA 加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型 杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001%或者几乎 检测不到。
[0003] 玉米螟是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米螟危害造成玉米产量损失在5%左 右。我国是玉米螟的多发和重发区，20世纪70年代以来，几乎每两年就大发生一次，年损失 玉米380-640万吨，相当于一个中等玉米省的产量。
[0004] 由于玉米的内源抗虫性是受多基因控制的，且心叶期靶标害虫和穗期靶标害虫基 因各自独立遗传，用常规育种方法培育抗螟杂交种不仅周期长，而且很难获得兼抗两个世 代玉米螟的亲本。同时，玉米抗螟基因很有可能与高产性状呈负相关，20年来各国抗螟育种 均未取得明显进展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种重组DNA片段。
[0006] 本发明所提供的重组DNA片段包括如下1) -3)的元件：
[0007] 1)启动子；
[0008] 2)由所述启动子启动转录的抗虫基因（命名为mCrylAh);所述抗虫基因的核苷酸 序列如下述a)或b)或c)所示：
[0009] a)序列表中序列3 ;
[0010] b)序列表中序列3的第1-2007位；
[0011] c)与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98%的同一性，且编码序 列9所不蛋白质（命名为CrylAh蛋白）；
[0012] 3)终止序列。
[0013] 可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启 动子，和诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S ;西红柿蛋白酶抑制剂II 启动子（PIN2)或LAP启动子（均可用茉莉酮酸曱酯诱导）；热休克启动子；四环素诱导型 启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子PF128,种子贮存蛋白质特异的启动 子，例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的启动子等。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述启动子为Ubi启动子，来源于玉米，为组成型表达 启动子，其序列具体为序列表中序列6,或与序列6至少具有80%的同一性，且具有启动子 功能。
[0015] 可用于本发明的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（N0S终 止子）、花挪菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、婉? rbcS E9终止子和胭脂氨酸和 章鱼氨酸合酶终止子。
[0016] 所述转录终止序列具体为PolyA加 T-NOS的双终止序列，如序列表中序列7所示， 或与序列7的位至少具有80%的同一性，且具有转录终止功能的序列。
[0017] 在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段还包括OMK序列。所述OMK序列由 Ω序列和Kozak序列顺次连接组成，其序列具体为序列表中序列5,或与序列5至少具有 80%的同一性，且具有增强子功能。
[0018] 所述Ω序列和Kozak序列来源于烟草花叶病毒，为增强子，负责增强所述抗虫基 因的表达。
[0019] 在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段由所述Ubi启动子、所述OMK序列、所 述抗虫基因和所述转录终止序列顺次连接组成，命名为Ubi-OMK-mCryIAh-PolyA-T-NOS ; 其序列具体如序列表中序列11所示。
[0020] 其中，序列3由2010个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子，编码序列表中序 列9所示的CrylAh蛋白。序列5由67个核苷酸组成。序列6由2009个核苷酸组成。序 列7由488个核苷酸组成。序列9由668个氨基酸组成。序列11由4605个核苷酸组成，其 中第1-2009位为Ubi启动子序列，第2010-2076位为OMK序列，第2083-4092位为mCyrIAh 序列，第4118-4605位为转录终止序列。
[0021] 含有所述重组DNA片段的重组细胞系、转基因植物或转基因微生物也属于本发明 的保护范围。
[0022] 所述重组细胞系可以为真核细胞，也可以为原核细胞，如植物细胞系。在本发明的 一个实施例中，所述转基因植物（如玉米）包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。所述转 基因微生物为转入所述重组DNA片段的农杆菌LBA4404。
[0023] 所述重组DNA片段在培育抗虫转基因玉米中的应用也属于本发明的保护范围。所 述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0024] 在本发明的一个实施例中，所述玉米具体为玉米HiII。
[0025] 在本发明中，所述抗虫具体为抗玉米螟。
[0026] 实验证实，本发明所提供的人工合成的抗虫基因（序列3)的转基因玉米，其 Cry IAh蛋白蛋白的表达量明显提尚，每克（鲜重）叶片中Cry IAh蛋白的表达量可达 3. 18 μ g，而原始基因表达量仅为1.01 μ g。同时，本发明所提供的人工合成的抗虫基因（序 列3)的转基因玉米对革巴标害虫的抗性也明显提高，转入mcryIAh基因的T 6代植株，在玉米 5-6叶期接虫后，无明显的虫害，表现正常；而转cryIAh基因（优化前，序列2)及非转基因 植株，在接虫后，虫害非常严重。
【附图说明】
[0027] 图 1 为载体 pS3300-UMCT-UMG2、pS3300-UMG2-UCA 和 pS3300-UMG2-UC2A 的质粒 图谱。其中，A为pS3300-UMCT-UMG2的质粒图谱；B为pS3300-UMG2-UCA的质粒图谱；C为 PS3300-UMG2-UC2A 的质粒图谱。
[0028] 图2为转基因玉米CrylAh基因、mCrylAh基因和mG2-aroA基因的PCR检测图谱。 其中，A为转基因玉米CrylAh基因的PCR检测图谱；I :CK+(质粒阳性对照）；2 =Marker ;3 : CK (未加 DNA) ;4 :CK (非转基因玉米）；5-24 :转CrylAh基因玉米事件。B为转基因玉米 mCryIAh基因的PCR检测图谱；I :CK+(质粒阳性对照）；2 :Marker ;3 :CK (未加 DNA) ;4 : CK(非转基因玉米）；5-24:转mCrylAh基因玉米事件。C为转基因玉米mG2-aroA基因的 PCR检测图谱；I :CK+(质粒阳性对照）；2 :Marker ;3 :CK (未加 DNA) ;4 :CK (非转基因玉 米）；5_ 14 :转CrylAh基因玉米事件；15-24 :转mCryIAh基因玉米事件。
[0029] 图3为转基因玉米苗期草甘膦的耐受性检测结果。
[0030] 图4为转基因玉米田间抗虫性检测结果。其中，A为海南抗虫的转mCrylAh基因 玉米株系；B为海南不抗虫的非转基因对照株系。
【具体实施方式】
[0031 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例1、密码子优化型抗虫基因的获得
[0034] 本实施例根据CrylAh全长基因（核苷酸序列如序列表中序列1所示，参见中国专 利申请：200410009918. 9)编码蛋白的前667个氨基酸序列（前667个氨基酸序列如序列 表中序列8所示，对应的核苷酸序列如序列表中序列2所示），在保证氨基酸序列不变的前 提下，首先采用玉米偏好密码子对CrylAh基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有 密码子，并调整了密码子的使用频率（表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的 造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为 序列表中序列3。序列3与CrylAh基因（序列1)的l-2001bp(即序列2)的同源性只有 70%，而G+C含量由原来的37. 4%增加到56. 3%。同时为了便于克隆，在起始密码子后添 加 GGC三个核苷酸。序列3所示基因即为密码子优化型抗虫基因，将其命名为mcrylAh。密 码子在CrylAh基因和mcryIAh基因中的使用频率见表1。为方便克隆，发明人在序列3的 5'端引入SpeI酶切位点，在3'端引入AatII酶切位点，最终序列如序列表中序列4所示。 序列4的第7-2016位即为序列3。序列1的第1-2001位（即序列2)编码序列表中序列8 所不蛋白，序列3以及序列4的第7-2016位均编码序列9所不蛋白（与序列8所不蛋白相 比多出序列9自N端起的第2个氨基酸残基），将该蛋白命名为CrylAh蛋白。
[0035] 表1玉米优选密码子标准
[0036]
[0038] 实施例2、mcry IAh转基因玉米的获得
[0039] 一、重组表达载体 pS3300-UMG2-UCA 和 pS3300-UMG2-UC2A 的构建
[0040] 为了提高mcrylAh基因（序列3)在受体生物中的表达水平，发明人在构建 mcryIAh基因的重组表达载体时，在mcryIAh基因的5'端添加了 Ω序列和Kozak序列，Ω/ Kozak序列（简称0ΜΚ)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白基因 编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，5'端有一个UAUUUUUACAACAA序列 以及4个UUAC序列，这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。 Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白的序列。启动子 选用组成性启动子Ubi启动子，其序列如序列表中序列6所示。再则，在编码序列3'端设计 了 2