利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一 种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法。
【背景技术】
[0002] 蜘蛛种类繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112个科，3905个属，44000多种。 蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌的一种天然高分子蛋白纤维，具有优良的机械性能，如弹性好、强 度大、韧性强、耐高温和低温、耐冲击、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等优良特性， 其独特的综合性能是其他天然纤维和合成纤维所无法相比的。典型的蜘蛛丝有7种类型， 分别由7种不同丝腺分泌的不同的蛋白质分子组成。其中由大囊状腺（Major ampullate gland)分泌的主牵引丝（dragline silk)，呈放射状分布，构成蜘蛛网基本框架。牵引丝的 强度是钢的5倍，因而拥有"生物钢"之美誉。牵引丝的蛋白基因是高度保守的，主要由分 子量350kDa左右的、成对的牵引丝蛋白I(MaSpl)和牵引丝蛋白2 (MaSp2) 2种蛋白组成。
[0003] 黑寡妇蜘蛛（Latrodectus hesperus)牵引丝蛋白I (MaSpl)基因具有一个 单一外显子，全长9390bp，编码3129个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每1个重 复单元由4种初级类型重复序列Typel、Type2、Type3和Type4通过头尾串联而成 (Typel-Type2-Type3_Type4)，而每1种初级类型重复序列都包含了典型的（GA)n、An和GGX 蛋白基序。碱基和蛋白序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。MaSpl被认为是牵引丝具有 很强强度的主要分子基础。
[0004] 由于蜘蛛丝自身的产量低，且由于其相互残杀而不能通过大规模的饲养获得批量 的蜘蛛丝，所以限制了蜘蛛丝的广泛应用。随着生物技术的快速发展和对蜘蛛丝的编码序 列及吐丝机理的深入了解，已有采用各种异源表达系统来表达蜘蛛丝蛋白的研究，异源表 达系统包括大肠杆菌、酵母（Pichia pastoris)、昆虫细胞（sf9、BmN)、仓鼠的肾脏细胞、转 基因土豆、转基因烟草、转基因山羊、转基因老鼠、以及转基因家蚕。
[0005] 但是，至今为止使用的各种异源表达系统表达出来的蜘蛛丝蛋白的分子量较小， 有较多重组蛋白缺少一些关键的蛋白基序，有较多蛋白不是纯的蜘蛛丝蛋白分子，而是与 荧光蛋白等分子融合的融合蛋白，这些因素最终影响了外源蛋白的机械性能。因此，现有技 术缺少了一种方法能分泌出尽可能长的、单一蜘蛛丝蛋白分子的蜘蛛丝。
【发明内容】
[0006] 为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种利用家蚕丝腺生 物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法，利用转基因家蚕技术将黑寡妇蜘蛛牵 引丝蛋白1基因导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌单 一的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的家蚕，获得以家蚕丝为本底的黑寡妇蜘蛛牵引丝，用于蜘 蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0008] (1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSpl质粒作为在家蚕丝腺中 表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac[3 XP3-DSRed]-MaSpl质粒（如图1~图3 所示）以PiggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标 记基因的红色荧光DsRed基因表达框；
[0009] (2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBaC[3XP3-D SRed]-MaSpl质粒及能够提供 PiggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1 :1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的 受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]_MaSpl质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝 蛋白1基因插入到家蚕基因组内；
[0010] ⑶蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为Gl代，在 Gl代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的 转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
[0011] (4) G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基 因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
[0012] (5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配， 制成G4代；
[0013] (6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕 蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、 丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕；
[0014] (7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，并随家蚕吐丝结茧行 为进入蚕茧。
[0015] 所述的质粒pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl是以piggyBac转座子为基础并带有 Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的 两个功能表达框，一个功能表达框是3XP3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即 3 X P3Promoter - DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝 素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和家蚕丝素蛋白重链基因3'末端的 表达框，即 Fibroin H chain Promoter-Fibroin H chain signal peptide-MaSpI-Fibroin H chain PolyA0
[0016] 所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白I基因长度是包含2倍到16倍MaSpl基因重复单 jt Typel-Type2-Type3-Type4〇
[0017] 所述步骤（7)的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕 丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。
[0018] 本发明是先构建家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因的载体 pBac [3xP3-DSRed] -MaSp 1，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供 piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒（如图4所示）一起导入到家蚕受精卵内，依靠 piggyBac转座子的转座特性，使红色荧光蛋白基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因导入到 家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕丝腺细胞特异性合成 分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕，自交使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，育 成能分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕，然后利用该种家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛 牵引丝蛋白1。
[0019] 本发明具有的有益效果是：
[0020] 本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞 特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1具有功能活性。本发明 开发了一种新型的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1生产工艺，为大量生产黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白 1奠定了基础，同时也为提高蚕丝的机械性能奠定了基础。
【附图说明】
[0021] 图1是家蚕后部丝腺细胞合成分泌重组黑寡妇牵引丝蛋白1的 pBac [3 X P3-DsRed] -MaSpI X 2 质粒结构图。
[0022] 图2是家蚕后部丝腺细胞合成分泌重组黑寡妇牵引丝蛋白1的 pBac [3 X P3-DsRed] -MaSpl X 12 质粒结构图。
[0023] 图3是家蚕后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇重组牵引丝蛋白1的 pBac [3 X P3-DsRed] -MaSpl X 16 质粒结构图。
[0024] 图4是本发明涉及的piggyBac转座酶的辅助质粒结构图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0026] 本发明的实施例如下：
[0027] 本发明的三个实施例中的pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl X2质粒、 pBac [3xP3-DsRed]-MaSpl X 12 质粒和 pBac [3xP3-DsRed]-MaSpl X 16 质粒采用以下方式制 备合成：
[0028] A)先将家蚕丝素重链蛋白基因启动子（Fib-H-P)连到pMD18-T simple(Takara) 载体，并和基本的含有A3启动子（其碱基序列如SEQ ID NO. 3)和绿色荧光蛋白（其碱基序 列如SEQ ID NO. 4)表达框的piggyBac质粒piggy6212载体（其碱基序列如SEQ ID NO. 5) 分别经过Xhol/Ncol双酶切，胶回收重链启动子序列部分与piggyBac载体骨架连接，获得 piggy6609载体（其碱基序列如SEQ ID NO. 6)。
[0029] B)pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl质粒构建方法和步骤如下：
[0030] 根据已经报导的全长黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因（MaSpl)序列特征设计质粒， 并根据家蚕的密码子偏好性作了碱基优化，详细信息如下。
[0031] 人工合成家蚕丝素重链蛋白基因的信号肽、2倍的MaSpl分子的