br>[0064] II、碳源（葡萄糖）补加对豆渣发酵裂殖壶菌产油脂和DHA的影响；
[0065] III、氮源（豆渣酶解上清液）补加对豆渣发酵裂殖壶菌产油脂和DHA影响；
[0066] IV、碳源（葡萄糖）和氮源（豆渣酶解上清液）同时补加对裂殖壶菌的生长和DHA 产量的影响。
[0067] I、以豆渣为主要氮源的裂殖壶菌发酵培养基的优化，不同豆渣浓度对裂殖壶菌 的生长和DHA含量的影响。
[0068] 实施例1
[0069] 一种利用豆渣制备DHA的方法，包括如下步骤：
[0070] (1)豆渣预处理
[0071] 先将豆渣进行脱水干燥至豆渣含水量为20%左右，进行粉碎处理，过60目筛后进 行膨化；
[0072] (2)豆渣酶解
[0073] 称取40g膨化后的干豆渣按固液质量比1:20制成豆渣匀浆液，在豆渣匀浆液中加 入不超过0. 3 %质量含量的复合酶制剂，调节pH 4. 0,温度55°C，酶解24h，得到酶解混合 物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和豆渣酶解上清液，收集所有豆渣酶解上清液 用于下一步裂殖壶菌的发酵生产；所述复合酶制剂为体积比1:1的酶活均达到10000U/L的 纤维素酶和果胶酶；
[0074] 加蒸馏水将收集的豆渣酶解上清液定容至1L，获得的溶液即为豆渣浓度为40g/L 的豆渣酶解上清液（折合成豆渣的质量）；若需其他浓度的豆渣酶解上清液，只需相应调整 豆渣的用量即可；
[0075] (3)发酵培养基制备
[0076] 将葡萄糖和的豆渣酶解上清液，溶解在人工海水中，得到发酵培养基，所述培养基 中，葡萄糖浓度为l〇〇g/L，豆渣浓度为40g/L ;所述人工海水中包括如下质量含量的组份： 谷氨酸钠20g/L，硫酸钠10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵lg/L，氯化钾0. 2g/ L，氯化钙0. lg/L和微量元素。其中微量元素组成为：Na2EDTA 6mg/L，MnCl2 ·4Η20 0. 86mg/ L，CuS04.5H20 0.6mg/L，H3BO3 0.5mg/L，FeSO4 0.29mg/L，NiSO4 ·6Η20 0.06mg/L，CoCl2 ·6Η20 0.01mg/L，泛酸钙 0.0032mg/L;
[0077] (4)发酵罐体系的设置
[0078] 采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子培养两代后以4% (v/v)的接 种量接种于5L发酵罐中，5L发酵罐中装入3L上述发酵培养基，培养温度28 °C，起始转速 540rpm，通气量2vvm。自动流加 NaOH和柠檬酸，维持pH值在6. 5。在整个生长周期中，温 度全程采用28°C进行发酵。发酵过程中的溶氧通过控制通气量和搅拌速度来完成，将转速 与溶氧关联，设置540rpm为最低转速。前48h溶氧保持在约15%，从48~60h间维持在约 10 %，从60~72h间维持在约8 %，从72~84h间维持在约6 %，从84h到发酵过程终止约 为2%，发酵4天后，发酵终止，收获发酵液；
[0079] (5)裂殖壶菌的收集和干燥
[0080] 将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在15%左右，将物料打入喷雾干 燥器中，经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
[0081] 实施例2
[0082] 本实施例与实施例1的区别仅在于豆渣浓度为20g/L。
[0083] 实施例3
[0084] 本实施例与实施例1的区别仅在于豆渣浓度为60g/L。
[0085] 将实施例1-3所得的裂殖壶菌干粉分别进行如下实验测定：取适量裂殖壶菌干粉 加入浓HCl在60~70°C水浴锅中进行破壁，用正己烷提取油脂，55°C水浴旋转蒸发至恒 重，测其总油脂产量；取适量油脂和内标物（二十烷酸），按常规的BF 3-乙醚催化剂进行 KOH-CH3OH甲酯化，通过气相色谱法测定菌体中的DHA产量。
[0086] 实验结果如表1、图2和图3所示。
[0087] 表1发酵后期不同豆渣浓度下培养裂殖壶菌的脂肪酸组成
[0089] 结果表明：实施例1-3中，选用不同豆渣浓度的豆渣酶解上清液进行实验，经过4d 的发酵，如图3所示，当豆渣酶解上清液浓度为40g/L时，裂殖壶菌生物量，总油脂和DHA分 别达到最大值15. 4、6. 1和2. 8g/L ;当豆渣酶解上清液浓度为60g/L时，培养4d后裂殖壶 菌生物量、总油脂和DHA分别达到最大值14. 9、5. 8和2. 6g/L ;且结合表1中油脂在生物中 的含量，当豆渣酶解上清液浓度为40~60g/L时，总油脂在生物量中的含量达到了 38%以 上。豆渣酶解上清液的浓度是折合成豆渣的质量计算的。
[0090] 表1中列出了裂殖壶菌中各种分析脂肪酸的成分组成，当豆渣酶解上清液的浓度 从20增至40~60g/L时，饱和脂肪酸如肉豆蔻酸（C14:0)、棕榈酸（C16:0)的含量都在相 应的减少；而不饱和脂肪酸如DPA(C22:5)、DHA(C22:6)的含量都在相应的增加。因此豆渣 酶解上清液的浓度（即氮源浓度）的变化可能影响着脂肪酸从饱和到不饱和转变的这一重 要过程，可见氮源浓度在不饱和脂肪酸合成的过程中起着重要的作用。
[0091] II、不同浓度的碳源（葡萄糖）补加对裂殖壶菌的生长和DHA产量的影响
[0092] 实施例4
[0093] -种利用豆渣制备DHA的方法，包括如下步骤：
[0094] (1)豆渣预处理
[0095] 先将豆渣进行脱水干燥至豆渣含水量为20%左右，进行粉碎处理，过60目筛后进 行膨化；
[0096] (2)豆渣酶解
[0097] 称取50g膨化后的干豆渣按固液质量比1:20制成豆渣匀浆液，在豆渣匀浆液中加 入不超过0. 3 %质量含量的复合酶制剂，调节pH 4. 0,温度55°C，酶解24h，得到酶解混合 物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和豆渣酶解上清液，收集所有豆渣酶解上清液 用于下一步裂殖壶菌的发酵生产；所述复合酶制剂为体积比1:1的酶活均达到10000U/L的 纤维素酶和果胶酶；
[0098] 加蒸馏水将收集的豆渣酶解上清液定容至1L，获得的溶液即为浓度为50g/L的豆 渣酶解上清液（折合成豆渣的质量）；若需其他浓度的豆渣酶解上清液，只需相应调整豆渣 的用量即可；
[0099] (3)发酵培养基制备
[0100] 将葡萄糖和的豆渣酶解上清液，溶解在人工海水中，得到发酵培养基，所述培养基 中，葡萄糖浓度为120g/L，豆渣浓度为50g/L ;所述人工海水中包括如下质量含量的组份： 谷氨酸钠20g/L，硫酸钠10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵lg/L，氯化钾0. 2g/ L，氯化钙0. lg/L和微量元素。其中微量元素组成为：Na2EDTA 6mg/L，MnCl2 ·4Η20 0. 86mg/ L，CuS04.5H20 0.6mg/L，H3BO3 0.5mg/L，FeSO4 0.29mg/L，NiSO4 ·6Η20 0.06mg/L，CoCl2 ·6Η20 0.01mg/L，泛酸钙 0.0032mg/L;
[0101] (4)发酵罐体系的设置
[0102] 采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子培养两代后以4% (v/v)的 接种量接种于5L发酵罐中，5L发酵罐中装入3L发酵培养基，培养温度28°C，起始转速 540rpm，通气量2vvm。自动流加 NaOH和柠檬酸，维持pH值在6. 5。在整个生长周期中，温 度全程采用28°C进行发酵。分段溶氧控制发酵。发酵过程中的溶氧是通过控制通气量和 搅拌速度来完成，将转速与溶氧关联，设置540rpm为最低转速。前48h溶氧保持在约8%， 从48~60h间维持在约6%，从60~72h间维持在约4%，从72~84h间维持在约2%，从 84h到发酵过程终止约为1 %。发酵过程中，当发酵液中葡萄糖糖浓度低于5g/L时，开始补 加高浓度葡萄糖，控制补加后葡萄糖残糖浓度为l〇g/L ;当培养5d时，发酵终止，收获发酵 液。
[0103] (5)裂殖壶菌的收集和干燥
[0104] 将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在15%左右，将物料打入喷雾干 燥器中，经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
[0105] 实施例5
[0106] 本实施例与实施例4的区别仅在于控制补加后葡萄糖残糖浓度为30g/L。
[0107] 实施例6
[0108] 本实施例与实施例4的区别仅在于控制补加后葡萄糖残糖浓度为50g/L。
[0109] 实施例7
[0110] 本实施例与实施例4的区别仅在于控制补加后葡萄糖残糖浓度为70g/L。
[0111] 按前述实验方法测定实施例4-7所得发酵液中生物量、油脂及DHA产量，观察不同 补糖浓度对裂殖壶菌的生长和DHA含量的影响。结果见表2。
[0112] 表2不同浓度的葡萄糖补加下的发酵参数
[0114] 结果表明：实施例4-7中的葡萄糖补料方式均提高了底物利用率，提高了生物量、 总油脂和DHA产量。除了实施例7补加70g/L葡萄糖产量提高不明显外，其余浓度的补加 均有不同程度的提升。原因可能是补加葡萄糖浓度过高，抑制了菌体生长。故补加50g/L 的葡萄糖组产量提高程度不如补加葡萄糖浓度30g/L。补加10g/L的葡萄糖虽缓解一部分 碳源缺乏的菌体生长，但生物量和DHA产量提高程度不如补加葡萄糖浓度30g/L。固本发明 优选控制补加后葡萄糖残糖浓度为20-40g/L。
[0115] 其中，实施例5补加浓度为30g/L的葡萄糖组获得的裂殖壶菌干粉的营养组成为 (%，干菌粉重量）：蛋白质13.2%、粗脂肪55.4%、碳水化合物10.4%、水分6.5%，其中 DHA占菌体干重的含量为26. 5%。
[0116] III、不同浓度的氮源（豆渣酶解上清液）补加对裂殖壶菌的生长和DHA产量的影 响
[0117] 实施例8
[0118] -种利用豆渣制备DHA的方法，包括如...