一种通量定量测定菌株降氮能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明饲用微生物领域，具体涉及一种通量定量测定菌株降氮能力的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，人们在不断提高养殖密度以追求养殖产量的同时，也造成了一系列常见的问题。如水体中过量的有机质分解不仅消耗水体中的溶解氧，且释放出许多有害物质，如氨氮、亚硝态氮等，因而水产养殖池塘水质的控制和净化已是我国池塘水产养殖健康发展的关键问题。为了研发出高效的水质改良制剂，为所需种源的筛选提供快捷的方法显得尤为重要。
[0003]目前，有许多可定性和定量测定水体中氨氮和亚硝态氮的方法。定性测定方法操作简单，但不同操作人员、不同测定批次的测定结果不具有可比性；现有的一些定量测定方法，如测定污水中氮含量的方法，测定食品中氮含量的方法(见GB/T12763.4-2007)，存在同时测定数量少，操作繁琐，试剂众多，且部分试剂有毒，结果计算复杂，结果不稳定等缺点，且最重要的是，目前还没有针对菌株降氮能力测定的定量的方法，还要符合适用于水产养殖这一条件。
[0004]因此，在接近实际生产养殖的条件下，建立一种定量准确测定样品中氨氮和亚硝态氮含量的方法，对于水质改良制剂时种源的筛选非常重要。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供一种通量定量测定菌株降氮能力的方法。
[0006]本发明提供的通量定量测定菌株降氮能力的方法，其为将待测菌株菌液接入相应的以粉碎虾料为唯一碳源的筛选培养基中，振荡培养后，将培养物离心取上清液，加入96孔板；测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液后，每孔先后加入格里斯试剂A、B，于550nm测定吸光值；测定氨氮时每孔加入纳氏试剂，于450nm测定吸光值，然后通过建立的标准曲线计算出体系中剩余氮浓度，从而计算出菌株的降氮能力；其中，氨氮筛选培养基的氮源以NH/-N为唯一氮源；亚硝态氮筛选培养基以N02 -N为唯一氮源的氮源。
[0007]其中，亚硝态氮浓度￥1与测定0D值Xi之间参考标准曲线为Y1=3.508Χ「0.191 ;氨氮浓度Υ2与测定0D值Χ2之间参考标准曲线为Υ2 =14.085Χ2-0.620。
[0008]其中，待测菌株接种终浓度为5 X 104 5CFU/mL。
[0009]在本发明一个实施方案中，测定亚硝态氮时，菌株培养物上清液与格里斯试剂A、B的体积比优选为10:1:1 ;测定氨氮时，菌株培养物上清液与纳氏试剂的体积比优选为
10:1ο
[0010]其中，菌株振荡培养条件为培养28-33°C，150-200 r/min，培养24_48h。
[0011]其中，所述的N02 -N优选由NaN02提供，亚硝态氮浓度优选为2.5mg/l ;所述的NH/-N优选由(NH4) 2S04提供，铵态氮浓度优选为2.5mg/l。
[0012]其中，所述的筛选培养基中粉碎虾料的浓度优选为1.0g/L。
[0013]在本发明优选的实施方案中，所述的菌株为芽孢杆菌，更优选为枯草芽孢杆菌。
[0014]为了保证筛选得到的菌株在实际养殖环境下发挥作用，配制筛选培养基中只使用虾料作为唯一碳源，且通过科学计算得到添加量:由生产实际调查可知，1000立方水体，养殖2000kg虾，即每立方米水体2kg虾，又知，在全程养殖中，有30%的虾料被虾吸收，70%的虾料沉积中水体中(其中，20%未被利用，50%被排泄掉)，通过计算得到每L水体中大约有1.4-1.5g虾料沉积下来，即每50mL水中添加0.075g虾料即接近实际养殖条件，在本发明中为了提高筛选标准，应用每50mL水中添加0.05g虾料进行测定。使用虾料作为唯一碳源:养殖实际环境中的主要碳源即为虾料，虽然有的养殖户会使用红糖、葡萄糖等活化液体菌剂，但本发明方法是为了保证筛选出来的菌株在碳源浓度低和可利用碳源有限的条件下，也能够很好地发挥作用，且可使养殖户节省养殖成本。
[0015]本专利定量测定菌株降氮能力的通量方法具有如下优点:
1、高效的前提:共筛选高效降氮菌的样品目标明确:采用福建、江苏虾池的水、泥样样品，此类样品按照高温的方法处理后，并按照本专利中的方法进行筛选，可获得优良安全的高效降氮的芽孢杆菌。
[0016]2、本发明方法简明易行，培养基成分简单易准备，成本低。
[0017]3、筛选结果可信度高。统一的筛选培养基、培养条件、测定条件、实现量化的标准曲线，同一测定对象，多次重复检测，结果一致性高。
[0018]4、获得高效菌株的应用效果好。经过该种方法测定，得到的菌株制成菌液或者菌粉，降氮效果得到验证。
[0019]本发明方法与传统方法相比，可以进行批量(彡96个)样品的同时处理和测定，高效且准确。
【附图说明】
[0020]图1所示为实施例148株初筛菌株亚硝态氮降解能力测定结果。
[0021]图2所示为实施例148株初筛菌株氨氮降解能力测定结果。
[0022]图3所示为实施例2菌株亚硝态氮降解能力复筛测定结果。
[0023]图4所示为实施例2菌株氨氮降解能力复筛测定结果。
[0024]图5所示为实施例3六种不同芽孢杆菌菌粉亚硝态氮降解能力测定结果。
[0025]图6所示为六种不同芽孢杆菌菌粉氨氮降解能力测定结果。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027]实施例1菌株降氮能力初筛
将48株菌单菌落接入LB液体培养基中进行扩大培养16h，进行活菌数测定后，进行各菌株的降氮能力测定实验。
[0028]测定方法:在超净台中，将48株待测菌株菌液接入相应筛选培养基中，每株菌接种终浓度为5X105CFU/mL，重复数为3 ;放入摇床中进行培养30°C，180 r/min，培养24、48h ;均勻取样到1.5mL离心管中，12000 r/min离心3min,取上清200 μ L加入96孔板。
[0029]测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200 μ L后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20 μ L,于550nm比色测定；测定氨氮时每孔加入纳氏试剂20 μ L,于450nm比色测定。
[0030]定量测定:首先制定标准曲线。选取亚硝态氮浓度依次为0、0.05、0.10、0.20、0.40,0.80,1.60、3.20、6.40，单位为mg/L,获得亚硝态氮浓