血浆miRNA水平指导非小细胞肺癌适宜放疗剂量的检测技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物发明技术领域，具体地说，涉及一种血浆miRNA水平指导非小细胞肺癌适宜放疗剂量的检测技术。
【背景技术】
[0002]肺癌是发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，其主要的病理类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。放射治疗是肺癌的重要治疗手段，据统计，60% -70%的NSCLC患者在疾病的不同阶段需接受放射治疗。
[0003]但即使是根治性放疗也不能彻底消除肿瘤，常规分割放疗(convent1nalfract1nated rad1therapy, CFRT)两年复发率高达60%-70%，进一步提高肺癌放疗疗效是目前需迫切解决的问题。辐射抵抗严重影响放疗疗效，放疗前对患者辐射敏感程度进行评估，有助于制订最佳的放疗计划，提尚放疗疗效，但目如临床缺之敏感、有效的疗效预测指标。
[0004]微小RNA (mi croRNA，mi RNA)是一类保守的内源性非编码小RNA，在转录后水平调控靶基因的表达。在多种肿瘤的发生、发展过程中均起重要调控作用，最新研究发现，其与放化疗抵抗、肿瘤干细胞特性维持、上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymaltransit1n, EMT)等生物学特征也密切相关。miRNA表达具有组织特异性，在血楽中可稳定表达，并可进行定量检测分析，因此血浆miRNA有望成为肺癌放疗疗效预测的新型指标。
[0005]相对而言，作为技术人员来说，开发一种血浆miRNA水平指导非小细胞肺癌适宜放疗剂量的检测技术，设计合理，血浆miRNA可反映肿瘤细胞的生物学特性，检测血浆miRNA表达水平，从而预测肺癌放疗敏感性，具有快速、简洁、准确的优点，对肺癌放疗的临床应用具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种血浆miRNA水平指导非小细胞肺癌适宜放疗剂量的检测技术，设计合理，血浆miRNA可反映肿瘤细胞的生物学特性，检测血浆miRNA表达水平，从而预测肺癌放疗敏感性，具有快速、简洁、准确的优点。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:
[0008]血浆miRNA水平指导非小细胞肺癌适宜放疗剂量的检测技术，特征在于:
[0009](1)、抽取肺癌患者放疗前外周血，提取血浆；
[0010](2)、分离纯化血浆总RNA ；
[0011](3)、以cel-miR-39-3p (cel-39)作为外参照，与miR-18a_5p反转录引物一起进行反转录；
[0012](4)、加入miR-18a-5p PCR引物进行10个循环的预扩增；
[0013](5)、加入cel-39引物与miR-18a_5p PCR引物，qPCR法检测肺癌患者血浆miR-18a_5p 水平；
[0014](6)、miRNA 判读标准:miR-18a-5p/cel-39>2.28。
[0015]作为一种优化的技术方案，步骤(2)分离纯化血浆总RNA的方法如下:
[0016]1)取 200 μ 1 血浆于 1.5ml EP 管中；
[0017]2)向EP管中加入1000 μ 1 QIAzol Lysis Reagent裂解液，旋转混匀；
[0018]3)室温下放置5min;
[0019]4)加入200 μ 1三氯甲烷，旋转混匀15s ；
[0020]5)室温下放置2-3min ；
[0021]6)4°C，12000g 离心 15min ;
[0022]7)将上清液(600 μ 1)转移到新1.5ml EP管中，加入900 μ 1无水乙醇；
[0023]8)将步骤 8 的混合液体 750 μ 1 加入 2ml RNeasy MinElute Spin Columns，室温lOOOOrpm离心15s，弃下层液体；
[0024]9)重复步骤8)；
[0025]10)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 700 μ 1 RWT buffer, lOOOOrpm离心15s，弃下层液体；
[0026]11)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 RPE buffer, lOOOOrpm离心15s，弃下层液体；
[0027]12)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 80% 无水乙醇，lOOOOrpm离心2min，弃下层液体；
[0028]13)将洗脱膜植入新2ml收集管，最高速度离心5min ；
[0029]14)将洗脱膜植入新1.5ml收集管中，加入20 μ 1无酶水，最高速度离心lmin ；
[0030]15)离心后，收集管中即为总RNA ；
[0031]16)使用超微量分光光度计测量提取的总RNA浓度。
[0032]作为一种优化的技术方案，步骤(3)反转录的方法是:
[0033]1)配置反转录液(20 μ 1):
[0034]5XPrimeScriptBuffer,4 μ 1 ；
[0035]PrimeScriptRT Enzyme Mix，1 μ 1 ；
[0036]miR-18a-5p 反转录引物(2 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0037]cel-39 反转录引物(2 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0038]cel-39standard(0.1 μ Μ)，1 μ 1 ；
[0039]总RNA(lOOng)，1 μ 1
[0040]无酶水，补足20 μ 1。
[0041]2)反应条件:
[0042]Stepl:42°C, 15min ；
[0043]Step2:85°C，5s。
[0044]步骤(4)预扩增方法是:
[0045]1)配制预扩增液(12.5 μ 1)
[0046]cDNA，1 μ 1 ；
[0047]miR-18a-5p 上游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0048]miR-18a-5p 下游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0049]2 X Taq PCR MasterMix,6.25 μ 1 ；
[0050]无酶水，4.25μ1;
[0051 ]2)反应条件(普通PCR仪)
[0052]Reps:94°C，3min ;
[0053]Reps:94°C，30s ;60°C，30s ；72°C, lmin ;lOcycles ；
[0054]Reps:72°C, 5min0
[0055]作为一种优化的技术方案，步骤(5) qPCR方法是:
[0056]1)配制PCR反应液(20 μ 1体系)
[0057]SYBRPremix Ex Taq II, 10 μ 1 ；
[0058]上游引物(10uM)，0.5 μ 1 ;
[0059]下游引物(10uM)，0.5 μ 1 ;
[0060]ROX II，0.4 μ 1 ;
[0061]预扩增液，2μ1;
[0062]无酶水，6.6 μ 1 ;
[0063]2)反应条件
[0064]Reps:95°C, 30s ；
[0065]Reps:95°C，5s ;60°C，34s ;40cycles。
[0066]作为一种优化的技术方案，步骤￠)中判读标准:miR-18a-5p/cel-39>2.28。
[0067]由于采用了上述技术方案，本发明该检测技术中miR-18a_5p的敏感性和特异性分别87%和95%。miR-18a-5p/cel-39>2.28的患者，给予较低放疗剂量(56-60Gy)，miR-18a-5p/cel-39彡2.28的患者，给予较高放疗剂量(66_70Gy)。
[0068]本发明设计合理，血浆miR-18a_5p可反映肿瘤细胞的生物学特性，检测血浆miR-18a-5p水平，预测肺癌患者放疗敏感性，具有快速、简洁、准确的优点。
【具体实施方式】
[0069]实施例:
[0070]血浆miRNA水平指导非小细胞肺癌适宜放疗剂量的检测技术，总的方法如下:
[0071](1)、抽取肺癌患者放疗前外周血，提取血楽；
[0072](2)、分离纯化血浆总RNA ；
[0073](3)、以cel-miR-39 (cel-39)作为外参照，与miR-18a_5p反转录引物一起进行反转录；
[0074](4)、加入miR-18a-5p PCR引物进行10个循环的预扩增；
[0075](5)、加入cel-39引物与miR-18a_5p PCR引物，qPCR法检测肺癌患者血浆miR-18a_5p 水平；
[0076](6)、miRNA 检测标准:miR-18a-5p/cel-39>2.28。
[0077]具体来说，步骤(2)分离纯化血浆总RNA的方法是:
[0078]1)取 200 μ 1 血浆于 1.5ml EP 管中；
[0079]2)向EP管中加入1000 μ 1 QIAzol Lysis Reagent裂解液，旋转混勾；
[0080]3)室温下放置5min ；
[0081]4)加入200 μ 1三氯甲烷，旋转混匀15s ；
[0082]5)室温下放置2_3min ；
[0083]6) 4°C，12000g 离心 15min ；
[0084]7)将上清液(600 μ 1)转移到新1.5ml EP管中，加入900 μ 1无水乙醇；
[0085]8)将步骤 8 的混合液体 750 μ 1 加入 2ml RNeasy MinElute Spin Columns，室温lOOOOrpm离心15s，弃下层液体；
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