一种甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于甲、乙型流感 病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 呼吸道病毒（Viruses associated with respiratory infections)是指主要以呼吸 道为侵入门户，首先在呼吸道粘膜上皮细胞中增殖引起呼吸道以及全身感染，造成呼吸道 及其他器官损害的病毒的总称。临床上的急性呼吸感染中有90~95%是由这群毒引起的。 呼吸道病毒多为单链RNA (ssRNA)病毒，一般具有包膜及刺突，主要经呼吸道传播，定位于 呼吸道，可反复感染，人群流行率高。其中，流行性感冒病毒（influenza virus)和呼吸道 合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV)为临床常见的、重要的呼吸道病毒。
[0003] 呼吸道合胞病毒形态为球形，基因组为线性、不分节段的单链RNA (ssRNA)，病 毒体有包膜，膜上有刺突，由糖蛋白组成，无血凝素（hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶 (neuraminidase, NA)。根据病毒表面蛋白抗原的变异，可将RSV分为两种类型：RSV A型 和RSV B型。
[0004] 呼吸道合胞病毒肺炎（respiratory syncytial virus pneumonia)简称合胞病毒 肺炎，由呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV)引起的一种小儿常见的间 质性肺炎，多发生于婴幼儿。由于母传抗体不能预防感染的发生，出生不久的小婴儿即可发 病，但新生儿较少见。国外偶有院内感染导致产科医院新生儿病房爆发流行的报道。该病 的诊断主要根据病毒学及血清学检查结果。近年来利用鼻咽分泌物脱落细胞及血清中IgM 抗体的间接法免疫荧光技术、ELISA、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法（APAAP )、生物素 抗生物素 ELISA法、辣根过氧化物酶一抗辣根过氧化物酶法（PAP)、单克隆抗体荧光法等都 能进行合胞病毒感染的快速诊断。
[0005] 流行性感冒是由流行性感冒病毒引起的一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道 疾病，其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播，典型的临 床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是流行性感冒 的高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。
[0006] 流行性感冒病毒，简称流感病毒，是正粘病毒科（Orthomyxoviridae)的代表种，包 括人流感病毒和动物流感病毒。人流感病毒可分为甲型流感病毒（Influenza A virus)、 乙型流感病毒（Influenza B virus)和丙型流感病毒（Influenza C virus)三种类型。其 中，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行；乙型流感病毒 的抗原变异较小，仅在人类之间传播，通常只引起流感的局部爆发，乙型流感通常伴有肌炎 及胃肠道症状，在某些年份可成为强势株。相较于甲型流感病毒，乙型流感病毒更容易引起 较为严重的合并症；丙型流感病毒的抗原稳定，且致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下 的人群。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直 到1949年才成功分离。
[0007] 在流感病毒流行期结合临床症状诊断流感并不困难，但要确诊或流行监测时必须 进行实验室检查，主要包括病毒分离培养、血清学诊断和快速诊断方法。近年来，分子生物 学方法不断被应用到流感病毒的快速检测中，流感病毒的实验室诊断方法取得了很大的进 展，核酸检测已经成为了流感病毒实验室诊断的发展方向。
[0008] 当前，基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了 PCR高敏感性、DNA杂交技 术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法，该方法取材简单，操作 方便，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染，具有简便、微量、快速、 高特异、高敏感等优点。因此，荧光定量PCR法是临床早期诊断病毒感染的最有价值的方法 之一。
[0009] TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸 探针，荧光基团连接在探针的5' -末端，淬灭基团在探针3' -末端。当探针完整或与靶序 列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在 进行PCR反应延伸过程时，7?冰NA聚合酶的5' 一3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧 光基团与淬灭基团分离，即产生焚光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产 物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团 信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。 该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了 PCR污染等问题。
[0010] 目前，国际上呼吸道病毒检测试剂主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合 胞病毒等联检试剂盒，或甲型流感病毒分型检测试剂盒等。国内有4家公司研制出了甲型 流感病毒和乙型流感病毒联合检测试剂，均已获国家生产许可，但尚无与呼吸道合胞病毒 联合检测的荧光PCR检测试剂盒。
[0011] 同时为避免反应结果的假阳性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用 dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP ;而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前 易于被UNG酶降解：这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因 UDG酶可裂解尿嘧啶 碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或双链DNA中消除dUTP而阻止DNA聚合 酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶在50°C以上即失去活性，这样经过热循环不会 破坏病人呼吸道病毒核酸。UNG酶对不含dUTP的模板无任何影响，因此，反应体系中只有从 呼吸道病毒阳性病人样本血清中提取的核酸因不被UNG酶降解而直接进行RT-PCR反应。
[0012] 而且，将人造的竞争性内参RNA (慢病毒）引入反应体系，以指示每个PCR反应管 的扩增情况，从而避免假阴性或部分抑制结果的出现。
[0013] 该技术通过对呼吸道病毒中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒基因 组全序列比对分析，分别获得针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的序列 特异性引物和荧光探针，通过检测人鼻咽拭子样本，确定该试剂盒的各种检测指标，确定该 试剂盒检测的特异性、灵敏度，为呼吸道病毒感染的确诊、病情程度判断、疗效评价、新药开 发等提供一个方便、廉价的检测手段。其关键技术为获得针对甲型流感病毒、乙型流感病毒 和呼吸道合胞病毒各自序列特异性的引物和荧光探针，制备高特异性、搞敏感性、重复性好 的呼吸道病毒荧光检测试剂盒。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的在于：提供一种用于甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合 检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。
[0015] 本发明的技术方案为：提供一种用于甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联 合检测试剂盒，采用一步法RT-PCR技术对三种呼吸道病毒RNA进行定性检测。在使用上海 复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂对人鼻咽拭子样本进行核酸提取后，直 接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需多次 重复循环、防止产物污染。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰、可靠性高。
[0016] 本发明提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、呼吸道病毒引物探 针、内参、阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照。其中，所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl (ρΗ8· 3) 20 mM、KCl 100 mM、明胶 0· 2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0· 4 mM、MgCl2 6 mM的混合液；所述的RT-PCR酶混合物为逆转录酶、7?冰NA聚合酶和UNG酶的混合物(逆转 录酶3 U/ μ 1，DNA聚合酶2 U/ μ 1，UNG酶I U/ μ 1);所述的呼吸道病毒引物探针为一 对甲型流感病毒核酸序列特异性引物、一对乙型流感病毒核酸序列特异性引物、一对呼吸 道合胞病毒核酸序列特异性引物、一对外源性内参系列特异性引物、一条甲型流感病毒型 特异性探针、一条乙型流感病毒特异性探针、一条呼吸道合胞病毒特异性探针和一条外源 性内参特异性探针的混合液（引物各6. 25 uM，甲型流感病毒特异性探针2. 5 uM，乙型流感 病毒特异性探针2. 5 uM，呼吸道合胞病毒特异