通过茎环结构阻断3’dna末端的聚合酶延伸的方法
【专利说明】通过茎环结构阻断3' DNA末端的聚合酶延伸的方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年4月26日提交的美国临时申请号61/816, 431的优先权，该申 请通过引用纳入本文用于所有目的。
[0003] 联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
[0004] 本发明部分得到NHGRI资助号：1R43HG005144-01的支持。联邦政府可享有本发 明的某些权利。
【背景技术】
[0005] 核酸试验通常采用DNA聚合酶，以及任选的具体DNA探针来生成试验信号。例如， 试验可采用标记的DNA寡核苷酸作为DNA聚合酶的引物。在这类试验中，DNA引物的结合 和延伸在试验结果的评估中起到作用。引物依赖性聚合酶试验的潜在失效模式的一个示例 是在没有引物杂交的情况下DNA聚合酶延伸的启动。这种失效可源于DNA靶分子或扩增子 的自启动或由混合物中其它模板分子的启动。
【发明内容】
[0006] 本文提供了用于防止聚核酸的3'末端启动聚合酶依赖反应的方法和组合物。该 方法包括向核酸的3'末端添加结构以防止聚合酶延伸。
[0007] 在一些实施方式中，提供了一种引物延伸产物所致假启动减少的进行引物延伸的 方法。在一些实施方式中，该方法包括：
[0008] 提供包含以下组分的反应混合物：
[0009] 包含5'末端和3'末端的单链多核苷酸模板，所述多核苷酸模板在3'末端的6个 核苷酸内包含5-25个核苷酸的双链茎；
[0010]引物，当该多核苷酸模板中存在靶序列则该云雾与该靶序列退火结合；和
[0011] 聚合酶；
[0012] 将反应混合物暴露于这样的条件即该条件下，当该靶序列存在则该引物与该靶序 列退火且该聚合酶以模板依赖的方式延伸引物；并且
[0013] 检测引物延伸产物的存在或量。
[0014] 在一些实施方式中，靶序列存在于多核苷酸模板中。
[0015] 在一些实施方式中，双链茎是茎环的部分，双链茎的两条链由环连接。在一些实施 方式中，环包含1-10个核苷酸。在一些实施方式中，双链茎包含3'端并且茎的3'端毗连多 核苷酸模板的3'末端。在一些实施方式中，双链茎包含3'端并且连接到茎的3'端是1-5 个核苷酸，这些核苷酸不构成茎的部分并且位于多核苷酸模板的3'末端。
[0016] 在一些实施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成双链莖的第一条链，该 茎的第二条链是与之区分的与该核苷酸序列互补的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，反 义寡核苷酸经阻断不被聚合酶延伸（例如，寡核苷酸不包含3' -OH部分）。在一些实施方 式中，双链茎包含3'端并且茎的3'端毗连多核苷酸模板的3'末端。
[0017] 在一些实施方式中，多核苷酸模板包含猝灭剂/焚光标签对中的一成员并且抑制 剂寡核苷酸与引物下游的多核苷酸模板退火，其中抑制剂寡核苷酸包含猝灭剂/荧光标签 对中的第二员，由此，当抑制剂寡核苷酸与多核苷酸模板退火时，来自标签的信号被猝灭。 在一些实施方式中，暴露包括用聚合酶来延伸引物，从而置换抑制剂寡核苷酸并使得猝灭 剂/荧光标签对不猝灭从而生成荧光信号；并且检测荧光信号并将信号的量与靶序列的存 在或量相关联。
[0018] 在一些实施方式中，该聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方式中，该聚合酶是RNA 聚合酶。在一些实施方式中，反应混合物中的核苷酸三磷酸整合到引物延伸产物中并且所 述核苷酸三磷酸中的至少一些包含标签。在一些实施方式中，核苷酸三磷酸包含荧光标签 和猝灭剂对，这样，当核苷酸三磷酸完整时，荧光标签被猝灭剂猝灭，而当核苷酸整合到引 物延伸产物时荧光标签不猝灭。
[0019] 也提供了包含5'末端和3'末端的单链多核苷酸，所述多核苷酸模板在3'末端的 6个核苷酸内包含5-25个核苷酸的双链茎。
[0020] 在一些实施方式中，双链茎是茎环的部分，双链茎的两条链由环连接。在一些实施 方式中，环包含1-10个核苷酸。
[0021] 在一些实施方式中，双链茎包含3'端并且茎的3'端毗连多核苷酸模板的3'末端。
[0022] 在一些实施方式中，双链茎包含3'端并且连接到茎的3'端是1-5个核苷酸，这些 核苷酸不构成茎的部分并且位于多核苷酸模板的3'末端。
[0023] 在一些实施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成双链莖的第一条链，所 述茎的第二条链是与之区分的与核苷酸序列互补的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，反 义寡核苷酸不包含3' -OH部分或者经阻断而不被聚合酶延伸。
[0024] 在一些实施方式中，双链茎包含3'端并且茎的3'端毗连多核苷酸模板的3'末端。
[0025] 在一些实施方式中，多核苷酸模板包含猝灭剂/焚光标签对中的一成员。
[0026] 在一些实施方式中，单链多核苷酸长10-5000个核苷酸。
[0027] 还提供了包含上述或本文其它地方所述的单链多核苷酸的反应混合物。在一些实 施方式中，多核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的一成员并且反应混合物还包含抑制剂寡 核苷酸，其中抑制剂寡核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的第二员，由此，当抑制剂寡核苷 酸与多核苷酸退火时，来自标签的信号被猝灭。在一些实施方式中，反应混合物还包含以下 中的至少一种（或全部）：DNA或RNA聚合酶；核苷酸三磷酸或脱氧核苷酸三磷酸；与单链多 核苷酸中的靶序列退火的引物；或抑制剂寡核苷酸，其中抑制剂寡核苷酸包含猝灭剂/荧 光标签对中的第二成员，由此，当抑制剂寡核苷酸与多核苷酸退火时，来自标签的信号被猝 灭。
[0028] 还提供了包含上述或本文其它地方所述的单链多核苷酸的试剂盒。
[0029] 还提供了制备上述或本文其它地方所述的单链多核苷酸的方法。在一些实施方式 中，该方法包括将包含模板核酸的核酸样品与DNA聚合酶和至少第一寡核苷酸引物接触以 形成混合物，所述第一寡核苷酸引物包含茎环，所述引物具有5'末端和3'末端并且从5' 末端到3'末端包含：任选的5'末端处不形成茎环部分的1-6个核苷酸，之后是形成茎环的 前一半茎的核苷酸，之后是形成茎环的环的核苷酸，之后是形成与前一半茎环杂交的后一 半茎的核苷酸，之后是在3'末端处与模板核酸互补的序列；并且将混合物暴露于这样的条 件，即所述条件下，使得第一寡核苷酸引物的3'末端与模板核酸退火并且DNA聚合酶以模 板依赖的方式延伸第一寡核苷酸引物的3'末端以形成包含模板核酸的互补物和第一寡核 苷酸引物的单链扩增子，从而扩增模板核酸。在一些实施方式中，混合物还包含含有与单链 扩增子互补的序列的第二寡核苷酸引物，并且其中暴露导致第二寡核苷酸引物与单链扩增 子退火并用DNA聚合酶延伸第二寡核苷酸引物以形成与单链扩增子互补并在多核苷酸的 5'末端处有茎环的多核苷酸，从而形成双链扩增子。
[0030] 在一些实施方式中，第二寡核苷酸引物具有3'和5'末端，并且第二寡核苷酸引物 包含在第二寡核苷酸引物的5'末端的3个核苷酸内结束的茎环。
[0031] 在一些实施方式中，暴露包括聚合酶链反应（PCR)。
[0032] 在一些实施方式中，第一或第二寡核苷酸包含标签，使得双链扩增子中的至少一 条链包含标签。在一些实施方式中，标签带荧光。
[0033] 在一些实施方式中，第一或第二寡核苷酸引物包含猝灭剂，使得双链扩增子中的 至少一条链包含猝灭剂。
[0034] 在一些实施方式中，莖的前一半和后一半各自有5-15个核苷酸。在一些实施方式 中，2-6个核苷酸形成茎环的环。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端处仅一 个核苷酸不形成莖环的部分。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端处的2个 核苷酸不形成茎环的部分。
[0035] 在一些实施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3'末端处并与模板核酸互补的序列 至少6个核苷酸长。
[0036] 还提供了包含茎环的寡核苷酸引物，所述引物具有5'末端和3'末端并且从5'末 端到3'末端包含：任选的5'末端处不形成茎环部分的1-6个核苷酸，之后是形成茎环的前 一半茎，之后是形成茎环的环的核苷酸，之后是与茎环的前一半反向互补的茎环的后一半 茎，之后是在3'末端处的序列（例如，与模板核酸互补）。
[0037] 在一些实施方式中，莖的前一半和后一半各自有5-15个核苷酸。在一些实施方式 中，2-6个核苷酸形成茎环的环。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端处仅一 个核苷酸不形成莖环的部分。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端处的2个 核苷酸不形成茎环的部分。在一些实施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3'末端处并与模 板核酸互补的序列至少6个核苷酸长。
[0038] 还提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的反应混合物。在一些实施方 式中，反应混合物还包含以下的一种或多种：DNA聚合酶；或具有与所述寡核苷酸引物不同 的序列的第二寡核苷酸。
[0039] 还提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的试剂盒。
[0040] 定义
[0041] 除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常 所理解的含义。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学 以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。使用标准技术进行核酸和肽合成。按 照本领域和各种通用参考文献所述的常规方法进行这些技术和步骤（通常参见，Sambrook 等，《分子克隆：实验室手册》（MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL)，第 2 版（1989) 冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港（Cold Spring Harbor，N. Y.)，其通过引用纳入本文），将它们引入本文全文中。本文所用的命名以及下述 分析化学和有机合成中的实验室步骤均为本领域熟知且常用。
[0042] 术语"扩增反应"指用于倍增核酸靶序列拷贝的任何体外方法。这类方法包括但 不限于聚合酶链反应（PCR)、DNA连接酶链反应（参见美国专利号4, 683, 195和4, 683, 202 ; 《PCR方案：方法和应用指南》(Innis等编，1990))、（LCR)、QBeta RNA复制酶、和基于RNA转 录（如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其它反应。
[0043] "扩增"是指将溶解置于足以进行多核苷酸扩增的条件下的步骤（如果反应的所有 组分是完整的）。扩增反应的组分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术 语"扩增"一般是指靶核酸的"指数"增长。然而，本文所用的"扩增"也可指核酸的选择靶 序列数量的线性增长，如由循环测序所得。
[0044] 术语"扩增反应混合物"是指包含用于扩增靶核酸的各种试剂的水性溶液。这些 试剂包括酶、各种缓冲剂、盐、扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。扩增反应混合物还可包含稳 定剂和其它添加剂以优化效率和特异性。根据上下文，混合物还可以是完整或不完整的扩 增反应混合物。
[0045] "聚合酶链反应"或"PCR"是指靶双链DNA的特定区段或子序列以等比级数扩 增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4, 683, 195和 4, 683, 202 ;和《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990。示例性PCR反应条件一般 包括两个或三个步骤循环。两步骤循环具有变性步骤，之后是杂交/延长步骤。三步骤循 环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是分开的