一种用于治疗前列腺癌的二萜类化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的猫爪草中分离得到的一种二萜类化 合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猫爪草RanunculiTernatiRadix为毛茛科植物小毛茛Ranunculusternatus Thunb.的干燥块根。本品呈纺锤形，多5~6个簇生，形似猫爪，长3~10mm，直径2~3mm，顶端 有黄褐色残茎或茎痕。表面黄褐色或灰黄色，久存色泽变深，微有纵皱纹，并有点状须根痕 和残留须根。质坚实，断面类白色或黄白色，空心或实心，粉性。气微，味微甘。猫爪草别名三 散草(浙江）、猫爪儿草(河南）、猫爪子(河南）、鸭脚板(安徽）、金花草(广西）。猫爪草性温， 味甘、辛，入肝、肺经，具有清热解毒、消肿散结、止咳祛痰等功效，临床用于治疗肺结核、淋 巴结结核、咽喉炎、疟疾等症。民间用猫爪草治疗淋巴结核，不论结核大小或是否化脓均有 较好的疗效。近年来因其有较好的抗肿瘤效果而成为研究热点。
[0003]近年来针对猫爪草化学成分的研究较少，其主要含有黄酮类及苷类、生物碱、挥发 油、有机酸等化合物。
[0004]据报道，猫爪草煎剂治疗淋巴结核180例，其有效率达100%，临床治愈率73.9%; 其注射液对小鼠S180、S37癌株有抑制作用其煎剂对痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄 球菌、四联球菌等均有显著抑制作用。另有报道猫爪草能诱生肿瘤坏死因子(TNF)。肿瘤坏 死因子是一组具有抗肿瘤、抗病毒、参与多种免疫调节过程的球蛋白，由于它能特异性地杀 死肿瘤细胞，而对正常组织细胞无不良影响，从而起到肿瘤免疫和肿瘤治疗的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从干燥的猫爪草中分离得到的一种二萜类化合物，含其 的药物组合物及其制备方法和应用。
[0006]本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007]具有下述结构式的化合物(I):
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将干燥的猫爪草粉碎，用70 ~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的 正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用70%乙醇洗脱8个柱体积， 收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用 正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、50:1、25 :1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 至IJ5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗 脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用75%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0012] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的载 体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
[0014]所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
[0015]本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016]该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017]所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018]图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物⑴计算ECD和实验ECD图；
[0020] 图3为不同浓度化合物（I)作用72h后PC3和DU145存活率；
[0021 ]图4为10.Omg/L化合物（I)作用不同时间后PC3和DU145存活率。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0023] 主要材料、试剂来源及仪器类型：
[0024]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0025]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0026] (a)干燥的猫爪草（10kg)粉碎，用75 %乙醇热回流提取(30LX3次），合并提取液， 浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6LX3次）、乙酸乙酯(6LX3次)和水饱和的正丁醇(6LX 3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用70%乙醇洗脱8 个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物（131g);(c)步骤(b)中70 %乙 醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1 (8个柱体积）、50:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、10:1(10个柱体积)和1:1(8个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组 分；（d)步骤(c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1(8个柱体积）、 10:1(8个柱体积)和5:1(6个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d) 中组分2(18g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液 等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)(230mg)。
[0027] 结构确证：白色无定形粉末;册43頂3显示[1+似]+为111/2 513.1702，结合核磁特 征可得分子式为C25H3QO1Q，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据3h(ppm，DMS0_d6，600MHz):H-1 (5.19，s)，H-3(2.41，m)，H-3(2.16，m)，H-6(5.25，s)，H-8(2.82，m)，H-9(2.61，t，J=12.0)， H-ll(1.35，m)，H-ll(1.99，m)，H-15(5.93，s)，H-17(5.54，d，J=1.8)，H-17(5.32，d，J= 1.8)，H-18(1.01，s)，H-19(1.01，s)，H-20(l.ll，s)，l-0Ac(2.04，s)，6-0Ac(2.14，s)，12-OCH3(3 · 02，s)，5-0H( 2 · 89，br，s);核磁共振碳谱数据(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 81 · 7(CH， C)，48.1(CH，8-C)，36.5(CH，9-C)，43.8(C，10-C)，35.4(CH2，11-C)，116.6(C，12-C)，166.0 (C，13-C)，139.4(C，14-C)，115.1(CH，15-C)，169.3(C，16-C)，115.7(CH2，17-C)，30.2(CH3， 18-C)，24.3(CH3，19-C)，16.4(CH3,20-C)，168.8(C3-0Ac)，20.7(CH3，1-0Ac)，172.1(C，6-OAc)，21 · 7(CH3，6-0Ac)，49 · 6(CH3，12-OCH3);碳原子标记参见图 1。13CNMR谱和DEPT谱显示 有25个碳信号，其中包括六个甲基(一个甲氧基），三个亚甲基(一个烯烃亚甲基），五个次甲 基(一个烯属次甲基，两个含氧次甲基），以及十一个季碳(两个烯烃碳，五个羰基碳，两个含 氧季碳hIR谱表明该化合物含有羟基和羰基(3510和1740CHT1)基团，此外其在218nm处有最 大紫外吸收，表明该化合物含有α，β_不饱和丁烯酸内酯结构。烯烃质子信号δΗ5.93(H_15， s)和位于低场的碳信号3(：166.0((：-13)，115.1((：-15)和169.3((：-16)也证实了这一结构的 存在。另外结合三个甲基信号6!11.01(出-18,8)，1.01(出-19,8)和1.11(出-20,8)，表明该化 合物是一个含有丁烯酸内酯结构单元的四环二萜类化合物。HMBC谱中，Η-1(δΗ5.19，?〇与-<^0〇13(3(：168.8);!1-6(3!15.25,8)与-(^0〇13(3(：172.1) ;12-0〇13(3!13.02,8)与(：-12(3 C116.6)的相关性表明C-1和C-6位连有乙酰氧基，C-12与甲氧基相连。在HSQC和HMBC谱中， 质子信号狃5.54((1，1=1.8他)和5.32((1，1=1.8抱）与碳信号0(：115.7，(：-17)直接相连，以 及与C-14(SC139.4)和C-13(SC166.0)长距离的相关性，表明C-14和C-17之间连有双键。综 合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如 图1所示，立体构型进一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0028]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0029] 一、材料和仪器
[0030] 前列腺癌细胞株PC3(ArCC-CRL-1435)、前列腺癌细胞株DU145(ATCC-HTB-81)。化 合物⑴自制，HPLC归一化纯度大于98%，用二甲基亚矾(DMS0)配制成浓度为1.0g/L的储存 液备用。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛 血清(FBS)购自Hyelone公司。青/链霉素为上海先锋药业产品。胰蛋白酶购自华美生物工程 公司。二甲基亚砜(DMSO)购自上海华舜生物工程公司。琼脂(Agarose)、二硫苏糖醇(DTT)、 苯甲基磺酞氟(PMSF)、四甲基乙二胺(TEMED)为Sigma公司产品。十二烷基磺酸钠(SDs)、三 氯甲基烷基甲烧(1'1^8)1'1^8-!1(31、1'1'；[1：01^-100为?1'0