孔板，每孔加100μ1细胞悬液。细胞在 37°C，100%相对湿度，5%C02培养箱中孵育24小时。
[0292]b)用培养基将待测化合物稀释至500μΜ后梯度稀释8次。按25μ1/孔加入细 胞。化合物作用终浓度从100μΜ至0μΜ，5倍梯度稀释，共10个浓度点。
[0293]c)细胞置于37°C，100%相对湿度，5%C02培养箱中孵育72小时。
[0294] d)吸弃培养基，加入含10% CCK-8的完全培养基置于37°C培养箱中孵育2-4小 时。
[0295] e)轻轻震荡后在SpectraMaxM5MicroplateReader上测定450nm波长处的吸光 度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。
[0296] 数据处理
[0297] 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％ = [(4_AS)/ (Ac-Ab)]X100%
[0298] As:样品的0A(细胞+CCK-8+待测化合物）
[0299] Ac:阴性对照的0A(细胞+CCK_8+DMS0)
[0300] Ab:阳性对照的0A(培养基+CCK_8+DMS0)
[0301] 采用软件GraphpadPrism5拟合IC50曲线并计算出IC5。值。
[0302] 表2部分实施例化合物对酪氨酸激酶EGFR、HER2酶活抑制及A431细胞实验结果
[0303]
[0304] "一"表示活性未测试
[0305] 上述生物活性结果表明，本发明包括的部分化合物均具有较好的酪氨酸激酶EGFR 抑制活性以及HER2抑制活性，而且在细胞水平上实施例1、4、21也显示出明显的抑制A431 细胞活性。
[0306] 单次静脉或口服分别给予实施例1 (代号⑶DD-000261)和实施例21 (代号 CDDD-000257)在大鼠体内的药代动力学研究
[0307]本实验目的是通过单次静脉（IV)及口服（P0)给予SD大鼠供试品有效量的实施 例21化合物和实施例1化合物，于不同时间点采集血样，LC/MS/MS测定给予供试品后大鼠 血浆中供试品的浓度并计算相关参数和生物利用度。
[0308] 供试品的配制
[0309] 供试品，实施例21化合物和实施例1化合物溶于注射用水中，得到浓度均为5mg/ mL的溶液，用于静脉和灌胃给药。
[0310] 动物分配
[0311] 从上海西普尔-必凯实验动物有限公司购入大约6-8周龄的20只雄性SD大鼠 (雄性体重130_150g)，12只动物用于试验。在静脉和口服给药前，所有组别动物禁食过夜 (10-14小时），给药4小时后给食。
[0312] 给药
[0313] 供试品实施例21化合物和实施例1化合物通过静脉或口服单次给药。给药信息 见下表
[0316] 样品采集及处理
[0317]第 1-8 组动物采血时间点为：给药前，5min，15min，30min，lh，2h，4h，6h，8h和 24h。 每只动物每次经心脏穿刺采约〇. 25mL血液，K2EDTA抗凝。血液样本采集后置于冰上，离心 分离血浆（离心条件：8000转/分钟，6分钟，2-8°C)。收集的血浆分析前存放于-80°C。 此外，剩余没有用于实验研究的多余动物用于空白血的采集。离心后的空白血浆用于整个 研究中供试品的生物分析方法开发和生物样品分析。
[0318] 药物代谢动力学分析
[0319] 根据药物的血药浓度数据，使用药代动力学计算软件WinNonlin5. 2非房室模型 分别计算供试品的药代动力学参数。任何小于定量下限（LL0Q=Ing/mL)的数据用0值替 换，其平均值和标准差根据替换值进行计算。计算个体动物PK参数时任何小于定量下限的 数值将被剔除。
[0320] 实验结论
[0321] 雄性SD大鼠血浆中实施例21化合物药代动力学：
[0322] 动物静脉注射剂量为5mg/kg的实施例21化合物后，总清除率平均值2. 60L/hr/ kg。半衰期〇72)的平均值为1. 67hr。给药后Cmax平均值为3218. 39μg/L，Tmax平均值 为0. 083hr。AUC(O-t)值为1903. 30hr*yg/L。终期相表观分布容积平均值为6. 22L/kg。
[0323] 动物口服给予剂量为30mg/mL的实施例21化合物后，Cmax平均值为1528. 74μg/ L，Tmax平均值为0. 50hr，AUC(O-t)平均值为3736. 13hr*yg/L，半衰期（TV2)平均值为 2. 51hr。实施例21化合物平均生物利用度为33. 01%。
[0324] 雄性SD大鼠血浆中实施例1化合物药代动力学：
[0325] 动物静脉注射剂量为5mg/kg的实施例1化合物后，总清除率平均值3. 74L/hr/ kg。半衰期（TV2)的平均值为5.llhr。给药后Cmax平均值为616. 65μg/L，Tmax平均值 为0. 083hr。AUC(O-t)值为1309. 41hr*yg/L。终期相表观分布容积平均值为27. 66L/kg。
[0326] 动物口服给予剂量为30mg/mL的实施例1化合物后，Cmax平均值为296. 20μg/ L，Tmax平均值为5. 33hr，AUC(O-t)平均值为3593. 95hr*yg/L，半衰期（TV2)平均值为 5. 67hr。实施例1化合物平均生物利用度为47. 71%。
[0327] 对人表皮样癌A431裸小鼠皮下移植瘤的疗效比较
[0328] 药物名称和批号
[0329] CDDD-000257(即实施例21化合物）为白色粉末，含量99. 7%，批号4010057-78 ; CDDD-000261(即实施例1化合物）为淡黄色粉末，含量99. 1%，批号4010071-08 ;阳性对照 物CDDD-000275 (即阳性对照物gefitinib)为白色粉末，含量99%，批号R020-06-130619。
[0330] 配制方法：均用20%PEG400蒸馏水配制。
[0331] 实验动物
[0332] BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，早，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。合 格证号：SCXK(沪）2008-0016饲养环境：SPF级。
[0333] 实验步骤
[0334] 裸小鼠皮下接种人表皮样癌A431细胞，待肿瘤生长至100-200mm3后，将动物随机 分组（D0)。给药剂量和给药方案见表1。每周测2-3次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体 积（V)计算公式为：
[0335] V=l/2XaXb2其中a、b分别表示长、宽。
[0336] T/C(% ) = (T-TOV(C-CO) 100其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；TO、C0为实 验开始时的肿瘤体积。
[0337] 实施例21化合物、实施例1化合物、阳性对照物gefitinib(3、10、30mg/kg，P0,QD 21)均剂量依赖性地抑制高表达EGFR的人表皮样癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生长；其中 实施例21化合物和实施例1化合物高剂量组分别引起3/6小鼠肿瘤部分消退。荷瘤小鼠 对以上药物均能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。总体比较，3个化合物对人表皮样癌 A431裸小鼠皮下移植瘤抑瘤活性排序为：实施例21化合物〉实施例1化合物〉阳性对照 物gefitinib。
[0338] 表 1.CDDD-000257、CDDD-000261、CDDD-000275 对人表皮样癌A431 裸小鼠移植瘤 的疗效。
[0339]
[0340] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种如式I所示的化合物：其中： R2各自独立地选自下组：氢、取代或未取代的含1~6个碳原子的烷基、取代或未 取代的含1~6个碳原子的烷基酰基、取代或未取代的含3~6个碳原子的环烷基酰基、取 代或未取代的含2~6个碳原子的烯基酰基、取代或未取代的含6~10个碳原子的芳基酰 基、磺酰基、取代或未取代的含2~6个碳原子的酰胺基、取代或未取代的含1~6个碳原 子的胺基-酰基； 或RpR2与它们相连接的氮原子一起形成碳原子数为3至10个的取代或未取代的单环 或者多环含氮杂环基，或任意位置由氮原子、氧原子、硫原子置换的碳原子数为3至10个的 取代或未取代的单环或者双环含氮杂环基； 或札、R2与相连的氮原子及氮原子的邻位碳原子共同构成5~7元含氮杂芳基； R3选自下组：氢、取代或未取代的含1~6个碳原子的烷基、取代或未取代的含1~6 个碳原子的烷基酰基、取代或未取代的含1~6个碳原子的酰胺基、取代或未取代的含3~ 6个碳原子的环烷基酰基、取代或未取代的含2~6个碳原子的烯基酰基、取代或未取代的 含5~6个碳原子的芳基酰基、取代或未取代的含1~6个碳原子的烷基磷酸酯基； R为取代芳环或杂芳环上任意氢原子的一个或多个选自下组的取代基：卤素、 C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、羟基-C1-C4烷基、C2-C10杂环烷基、 C2-C10杂环烷基-氧基、羧基，或C2-C6羧酸酯基； Ar2选自下组：苯基、卤素取代的苯基、C1-C6烷基取代的苯基、联苯基、卤素取代的联苯 基、萘基、吡啶基、噻吩基、卤素取代的噻吩基、C1-C3烷基取代的噻吩基、呋喃基、卤素取代的 呋喃基，或C 1-C3烷基取代的呋喃基； A、B、D各自独立地选自下组：碳原子、氮原子、氧原子、硫原子或无；且A、B、D中至多仅 有一个为无； η = 0、1 或 2 ; 其中，除非特别说明，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基 取代：卤素、羟基、氧代、硝基、Cl~C6的卤代烷基、Cl~C6的烷基、Cl~C6的烯基、Cl~ C6的炔基、C3~C12的芳基、C3~C12的芳基烷基、Cl~C6的烷氧基、C3~C12的芳基氧 基、氨基、Cl~C6的酰基氨基、Cl~C6的烷基氨基甲酰基、C3~C12的芳基氨基甲酰基、 Cl~C6的氨基烷基、Cl~C6的酰基、羧基、Cl~C6的羟烷基、Cl~C6的烷基磺酰基、 C5~C12的芳基磺酰基、Cl~C6的烷基磺酰氨基、C5~C12的芳基磺酰氨基、C3~C12的 芳烷基磺酰氨基、Cl~C6的烷基羰基、Cl~C6的烯基羰基、Cl~C6的酰氧基、Cl~C6 的羟基-酰基、氰基、脲基、Cl~C6的烷基酰基、Cl~C6的环烷基酰基、磺酰基、氨基甲酸 醋基； 虚线为化学键或无。2. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于： A、B、D均为碳原子； Ar2为未取代或卤素取代的苯基；和/或 R1A2各自独立地选自下组：氢、含1~6个碳原子的烷基或取代的烷基、含1~6个碳 原子的烷基酰基、含3~6个碳原子的环烷基酰基、取代或未取代的含2~6个碳原子的烯 基酰基、取代或未取代的含6~10个碳原子的芳基酰基、磺酰基、取代或未取代的含2~6 个碳原子的酰胺基、取代或未取代的含1~6个碳原子的胺基-酰基； 或RpR2与它们相连接的氮原子一起形成取代或未取代的C3~ClO的杂环基，其中，所 述的杂环基具有1~3个选自下组的杂原子：0、S或N ; 或札、R2与相连的氮原子及氮原子的邻位碳原子共同构成5~7元含氮杂芳基。3. 如权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤： 在钯催化剂的存在下，用式（1)化合物与式（Ia)化合物进行偶联反应，得到式I化合 物：式中，各基团的定义如权利要求1中所述。4. 如权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：用式 (3)化合物与R3X反应，得到式I化合物 ：其中，X选自下组：Cl、OTs。5. -种酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂含有抑制有效量的如权利要求 1或2中所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐、互变异构体、光学异构体、药学上可接 受的溶剂合物。6. -种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有治疗有效量的如权利要求1 或2中所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐、互变异构体、光学异构体、药学上可接受 的溶剂合物。7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于治疗与酪氨 酸激酶过表达和/或酪氨酸激酶活性过高相关的疾病，或所述的药物组合物用于治疗与表 皮生长因子受体相关的疾病。8. 如权利要求5所述的抑制剂或如权利要求6中所述的药物组合物，其特征在于： 所述药学上可接受的盐是式I化合物的选自下组的盐：无机酸盐、有机酸盐、烷基磺酸 盐、芳基磺酸盐，或其组合；较佳地，所述的盐选自下组盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、 磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬 酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐，或其组合； 所述药学上可接受的溶剂合物，是指式I化合物与选自下组的溶剂形成的溶剂合物： 水、乙醇、异丙醇、乙醚、丙酮，或其组合。9. 如权利要求1或2任一所述的式I化合物的用途，其特征在于，用于： (a) 制备酪氨酸激酶抑制剂； (b) 用于体外非治疗性地抑制酪氨酸激酶的活性； (c) 用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞生长； (d) 用于制备治疗表皮生长因子受体活性相关的疾病的药物。10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的表皮生长因子受体选自下组：EGFR 和/或HER2。
【专利摘要】本发明提供了一类噻吩并嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用。具体地，本发明一种如式I所示的化合物，其中各基团的定义如说明书中所述。所述的化合物是一类有效的酪氨酸激酶抑制剂，特别适合用作EGFR和/或HER2抑制剂。
【IPC分类】C07D519/00, C07F9/6561, A61P35/00, A61P35/04, A61K31/675, A61K31/519, C07D495/04
【公开号】CN105418632
【申请号】CN201410483081
【发明人】安晓霞, 别平彦, 刘俊, 庄戈诗
【申请人】上海创诺医药集团有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2014年9月19日