一种用于免疫治疗的eb病毒lmp2a串联表位肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表 位肽及其应用。
【背景技术】
[0002] EB病毒（Epstein-BarrVirus，EBV)属于疱疹病毒γ亚科嗜淋巴细胞病毒成员， 是人类发现的第一个与肿瘤发生有关的人类病毒。ΕΒ病毒感染的靶细胞主要为Β淋巴细 胞。最近的研究证实，ΕΒ病毒还可感染人体Τ细胞、ΝΚ细胞、单核巨噬细胞。ΕΒ病毒感染与 多种疾病有关，如与非洲儿童Burkit淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、成人Τ/ΝΚ细胞淋巴 瘤、各种免疫抑制剂治疗患者和器官移植患者淋巴细胞增生紊乱引起的淋巴瘤及EBV相关 的噬血细胞增多症等密切相关。EB病毒感染靶细胞后表达多种蛋白，包括6种核抗原EBN A1、2、3A、3B、3C、和LP，3种潜伏期膜蛋白LMP1、2A、2B)和2种基因EBER-1、2，其中LMP2 (LMP2A、2B)在噬血细胞综合症、淋巴瘤和淋巴细胞增殖病细胞中均有表达。EB病毒的这些 蛋白抗原可以诱发机体的细胞免疫反应。
[0003] 自1964年在鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC)组织中首先发现存在有EB 病毒DNA以来，大量的血清流行病学研究已证明EB病毒与鼻咽癌有关。鼻咽癌是上皮来源 的恶性肿瘤，高发于东南亚及我国华南地区。临床上鼻咽癌通常不宜手术治疗，放疗、化疗 后也不能完全有效清除肿瘤细胞，部分患者易复发和转移，并且治疗产生的副作用又影响 了自身的免疫系统。因此目前，在倡导鼻咽癌综合治疗的同时更加注重免疫治疗。
[0004] T细胞只能识别由抗原递呈细胞（APC)递呈的抗原肽-MHC分子复合物。树突状细 胞（DC)是目前发现功能最强的APC，能激发初始型和记忆型T细胞，产生有效的CTL应答。 其以DC为基础的免疫治疗已在许多肿瘤的治疗中取得了良好的效果，可对肿瘤细胞进行 有效的靶向性杀伤，而不伤害正常细胞，是当前抗肿瘤免疫治疗研究的热点之一。但是，目 前的杀瘤效率都还较低。
【发明内容】
[0005] 针对以上技术问题，本发明公开了一种用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位 肽及其应用，将所述EB病毒LMP2A(latentmembraneprotein2A，潜伏膜蛋白2A)串联 表位肽负载人外周血来源的DCs，DCs可被有效地激活，诱导成熟并能够将其递呈到DCs (dendriticcells，树突状细胞)细胞表面，与CTL细胞共培养后可激活特异性的抗病毒CTL (cytotoxicTlymphocytes，细胞毒性T淋巴细胞)，并可分泌更多的细胞因子，促进淋巴细 胞的增殖，具有更显著的肿瘤杀伤功能，更高的肿瘤细胞杀伤效率。
[0006] 对此，本发明采用的技术方案为： 一种用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位肽，所述用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位肽包括SEQIDNO: 1的氨基酸序列。
[0007] 采用此技术方案，将LMP2A356364和LMP2A 426434进行串联，得到LMP2A串联表位肽 LMP2A356 364/426 434?LMP2A356 364和LMP2A426 434的序列为： LMP2A356364：FLYALALLL； LMP2A426434：CLGGLLTMV； 两者串联后得到的串联表位妝LMP2A356 364/426 434的序列为： 串联表位肽LMP2A:FLYALALLLCLGGLLTMV。
[0008] 用体外构建质粒，包装病毒转染DCs的方法虽然可使目的蛋白在DCs内表达，但 病毒的安全性在临床应用中仍受到一定限制，且不易被患者所接受。另外病毒对DCs的感 染效率和表达效率都与病毒包装的滴度相关，操作重复性较差。而采用抗原表位肽对DCs 直接负载，操作简便，可重复性高，而且经过实验证实发现LMP2A的串联肽与单个表位肽相 比，能更有效地诱导DCs成熟，促进特异性CTL的增殖，能够更加有效地靶向性杀伤鼻咽癌 细胞系。
[0009] 所述LMP2A串联表位肽356 364/426 434负载DCs后，能更加有效地促进DCs成熟和表 位肽递呈能力，可以分泌更多的细胞因子。负载了该串联表位肽的DCs与CTL共培养后，可 诱导出EB病毒特异性的CTL细胞，实验证明，其在体外和体内均可有效地靶向性杀伤鼻咽 癌细胞系CNE1。
[0010] 通过体外细胞培养方法激活和大量增殖患者自身的DCs，有效负载病毒的抗原多 肽，并与大量增殖的CTL细胞联合培养，再回输患者体内，直接提高了患者的抗病毒能力， 打破机体的免疫耐受状态。
[0011] 本发明还公开了所述用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位肽的应用，其用于EB 病毒相关的疾病的免疫细胞临床治疗中。进一步的，用于鼻咽癌的免疫细胞临床治疗中。
[0012] 鼻咽癌患者体内存在不同程度的免疫功能低下，其中DCs的数量和功能均有缺 陷，患者的抗原提呈细胞（AntigenPresentingCell,APC)往往不能正确地处理和提呈抗 原信号，直接影响了有效的CTL抗病毒反应。因此采用EB病毒LMP2A表位肽体外致敏DCs 再回输给患者，可大大提高DCs对病毒抗原的提呈能力，激发特异性CTL的免疫应答反应。
[0013] 本发明的有益效果为： 本发明的技术方案采用将EB病毒潜伏膜蛋白不同抗原多肽串联在一起，体外合成串 联表位肽，负载人外周血来源的DCs，发现其可以更加有效地促进DCs增殖和成熟，使其可 以分泌更多的细胞因子，负载了该串联表位肽的DCs与CTL共培养后，可激活特异性的抗病 毒CTL，诱导出EB病毒特异性的CTL细胞，促进淋巴细胞的增殖，在体外和体内均可有效地 靶向性杀伤鼻咽癌细胞系CNE1，且效果比单独应用LMP2A356 364或LMP2A426 434或两种表位肽 混合物更好。
[0014] 实验结果表明，与现有技术相比，采用本发明的技术方案能达到更高的诱导效率 和体外体内实验的有效性，其诱导效率比现有技术高10-20%。由此可见，本发明技术方案 的LMP2A串联表位肽在治疗鼻咽癌及EB病毒相关的其它疾病的免疫细胞临床治疗方面具 有巨大的应用潜力。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明一种实施例串联表位肽负载DCs的负载效率荧光检测结果图，从左 到右依次为放大100倍，200倍和400倍的图。
[0016]图2是本发明一种实施例采用流式细胞仪检测表位肽负载后DCs表型的检测分 析图。图中，LMP2A356-364/426-434DC为LMP2A串联表位肽负载DCs，LMP2Amix为混合 LMP2A356 364和LMP2A426 434表位肽负载DCs，LMP2A356-364DC为LMP2A356 364表位肽负载DCs， LMP2A426-434DC为LMP2A426 434表位肽负载DCs，下同。
[0017] 图3是本发明一种实施例负载了表位肽的DCs与T细胞的混合淋巴细胞反应六天 后流式细胞术检测PBL的增殖曲线图。
[0018] 图4是本发明一种实施例负载了串联表位肽的DCs活化T细胞分泌细胞因子的检 测图，其中A为IL-2分泌检测；B为IFN- γ分泌检测；C为TNF- α分泌检测。
[0019] 图5是本发明一种实施例负载了串联表位肽的DC-CTL体外的杀瘤效率检测分析 图。
[0020] 图6是本发明一种实施例负载了串联表位肽的DC-CTL治疗肿瘤模型动物的肿瘤 体积变化分析图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0022] 1、体外合成ΕΒ病毒串联表位肽 本发明中采用串联两个HLA*02:01型LMP2A表位肽，LMP2A356 364和LMP2A426 434的序列 为： LMP2A356364：flyalalll； LMP2A426434：clgglltmv； 将两者串联得到串联表位妝LMP2A356 364/426 434，得到的LMP2A串联表位妝的序列为：LMP2A串联表位肽：FLYALALLLCLGGLLTMV。
[0023] 将LMP2A串联表位肽负载DC细胞。
[0024] 按照现有技术的方法合成上述三种表位肽，本例的串联表位肽按照现有技术的常 规方法合成。经高效液相色谱和质谱分析鉴定证明合成的表位肽的序列和分子量均正确， 且纯度达到95%以上，符合实验要求。
[0025] 根据表位肽的溶解性，将其溶解在水或二甲基亚砜（DMS0)中，表位肽的储存液浓 度为10mg/ml，用0. 22μm的针筒滤器过滤除菌，分装后于-20°C保存。采用现有技术的方 法，进行表位肽负载DCs;表位肽负载DCs时表位肽的终浓度为40μg/ml。
[0026] 2、DCs和CTL的分离培养 (1)无菌条件下取正常人外周静脉血60ml，离心后取下层细胞层，加入PBS(Phosphate BufferedSaline，磷酸盐缓冲液）以1:1的比例进行稀释后，缓慢加入到淋巴细胞分离液 上，1000g室温水平离心25min，取中间白膜层细胞，用PBS洗两遍。
[0027] (2)DCs的体外培养和表位肽负载 加入RPMI1640培养基，调整细胞密度为2X106/ml，在10cm培养皿中加入5ml细胞悬 液，并放置于37°C，5%体积浓度的C02培养箱中贴壁培养2h。然后将其中的悬浮细胞作为 T细胞进行培养，贴壁细胞加入DCs培养基中，所述DCs培养基为含有100ng/mlGM-CSF和 50ng/mlIL-4的RPMI1640培养基。在37°C，5%体积浓度的C02培养箱中继续培养，每两 天半量换液。第六天，在不同培养皿中分别加入LMP2A串联表位肽、LMP2A356 364和LMP2A426 434 表位肽的混合物(两者浓度比例为1:1 )、表位肽LMP2A356 364、表位肽LMP2A426 434，终浓度均为 40μg/ml。第七天，分别加入50ng/mlTNF-α，培养48小时后检测DCs的表型。
[0028] (3)T淋巴细胞的培养和DC-CTL的体外诱导 将步骤（2)中的悬浮细胞作为T细胞进行培养。细胞浓度调整为107/ml，与步骤（2)中 负载了不同表位肽的DCs分别进行混合培养，DCs与CTL的比例为1:10。