一种简易的微流控芯片及细胞分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微流控芯片技术领域，具体地说是涉及一种用于细胞学分析的简易微流控芯片及细胞分析方法。
【背景技术】
[0002]细胞是生命体结构和生命活动单元，细胞增殖、分化、迀移和代谢等行为与胚胎发育、血管新生、组织修复、免疫防御、以及肿瘤发生等重要生理病理过程都密切相关，因此，对细胞的研究是现代生命科学研究的基础。
[0003]近年来，有报道将微流控芯片技术应用于细胞研究，给细胞研究提供了新的方法和平台。微流控芯片为细胞研究提供新的技术平台，其独特优势包括:与细胞相似的微流体通道尺寸；有效细胞微环境控制及细胞体内微环境模拟；减低分析试剂消耗；具备高通量和高内涵分析潜力；系统化集成等。基于上述优势，微流控芯片分析技术已在细胞生长和分化、细胞趋化、细胞迀移和细胞药物筛选等领域展开。
[0004]然而，微流控芯片研究中涉及的相关技术对于无相关经验的普通生物医学实验室仍是挑战。如现有微流控芯片大多是利用软光刻法加工制作微流控芯片，其制作过程较为繁复且需要借助一些昂贵、高精度的仪器来完成。例如:其掩膜的制作需借助高精度胶片打印机来完成；利用SU-8负性光刻胶光刻制作阳模的过程相当复杂、繁琐；大多数的芯片必须借助等离子表面处理器键合来完成封装；芯片灌胶必须借助精密仪器来完成等。而且此类芯片清洗困难，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了实验成本。这些都使微流控芯片在大多数生物医学实验室的应用受到了很大范围的限制。又如微流控芯片上成功的细胞培养是进行细胞分析的基础，其技术关键为细胞在空间受限的微通道内培养时营养物质提供。微通道内细胞培养主要采用灌注式培养，即通过外围流体灌注设备使细胞培养液持续在微通道内流动，从而为细胞提供营养物质并将细胞代谢废物移除。然而，培养液流动产生流体剪切力将对细胞造成一定的损伤，同时微流控芯片与外围液路的接口问题使细胞培养操作变得复杂。微通道内细胞培养另一种方式是采用静态培养，静态培养是细胞培养最常使用的方式，该方法虽不对细胞造成损伤，但将静态培养技术应用在空间受限的微通道内，仅通过扩散作用细胞常常不能获得足够的营养物质。
[0005]为此，基于上述微流控芯片加工、细胞培养及细胞响应分析的三大技术难点，本发明发展一种简易且易于在普通生物医学实验室开展的微流控芯片及细胞分析方法。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明首先提供了一种简易微流控芯片，该芯片相对于现有微流控芯片更易被普通生物学实验室采用加工和进行细胞培养及细胞分析的操作。
[0007]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0008]—种简易微流控芯片，其特征在于，包括基底层和位于所述基底层上的细胞培养层，所述细胞培养层上设置有位于同一平面的储液池，所述细胞培养层上还设置有微通道，至少两个储液池的底部由微通道连通。
[0009]进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述微通道为直微通道。
[0010]进一步，所述的一种简易微流控芯片，由微通道连通的储液池大小相同。
[0011]进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述微通道的宽度最低为30 μπι，深度为30 μ m-200 μ mD
[0012]进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述基底层为玻璃，所述细胞培养层为PDMS材质。聚二甲基娃氧烧(Polydimethylsiloxane，PDMS)是一种广泛应用于微流控等领域的聚合物材料。其是一种高分子有机硅化合物，具有无毒性、高透气性、透光性良好、生物相容性佳、易与多种材质室温接合等特点。此外，其成本低，使用简单，且有极佳的可塑性、热稳定性和化学惰性。由于以上显著优点，使其成为目前微流控芯片制作使用最多的聚合物材料，也常用于芯片封装、微流道、微混合器、微栗浦、微阀门等元件制作等领域。
[0013]进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述储液池与基底层连通。
[0014]微流控芯片的快速加工是开展微流控芯片分析的基础，因此，本发明还提供了一种快速加工微流控芯片的方法，该方法采用感光干膜代替了液态的光刻胶作为芯片阳模。
[0015]芯片阳模是微流控芯片加工的关键，传统软光刻工艺中主要采用液态SU-8光刻胶为基础，在洁净空间通过光刻技术加工而成。该技术主要缺点在于需要昂贵的仪器设备、及严格操作流程，在一定程度上限制了大多数生物医学实验室对该技术的应用。因此，本发明提供一种采用低成本的感光干膜替代液态光刻胶的制备方法，不但降低了微流控芯片加工成本和难度，同时不需要额外解决空间和大型设备，更易被普通生物学实验室采用加工。
[0016]感光干膜作为一种光聚合物材料主要应用于印刷板电路板工艺。相对于液体光刻胶，感光干膜具有诸多优势，如良好的适应性，基材粘附性、平整性、感光材料均匀分布性、低曝光功耗及低成本。更为重要的是，感光干膜光刻不需要超洁净空间和昂贵的光刻设备，作为液态光刻胶的替代物还可应用在微流体通道加工、电铸模具等。利用感光干膜制备微流控芯片可参考任何现有文献。而在本发明的一个具体实施例中，加工流程示意图如图4(A)所示，具体方法为:首先将三层感光干膜通过覆膜机依次层压在玻璃板上使感光层厚度约为100 μ m，将微通道图案通过爱普生喷墨打印机打印在透明胶片上制成光掩膜，紫外线透过光掩膜对感光干膜照射70s，1 %碳酸钠显影制成微通道阳模；将PDMS基质和固化剂按重量10:1混合而成的预聚物浇铸在微通道阳模上，抽真空除气泡，60°C下固化3h。将固化后的PDMS基片从感光干膜阳模上剥离，利用平头打孔器(直径5mm)在微通道两侧打孔形成储液池，氧等离子表面处理(30w，lmin)与载玻片进行不可逆键合，形成玻璃-PDMS复合微流控芯片。
[0017]与传统加工工艺比较而言，本发明采用一种低成本的感光干膜作为液态光刻胶的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和难度，同时不需要额外解决空间和大型设备，更易被普通生物学实验室采用加工。同时，在没有配置专业设备的基础上，利用该方法能够加工的微通道宽度最低为50 μ m，深度范围为30 μ m-200 μπι。同时，为简化芯片结构复杂度，避免引入外围的灌流设备，本发明设计的微流控芯片由储液池和微通道组成，储液池内的液体样品在静水压作用下进入微通道。
[0018]本发明的目的还在于提供一种利用上述设计的简易微流控芯片进行细胞培养及分析的方法，该方法是一种间歇性细胞动态培养分析方法，通过该方法，不但能够为细胞提供足够营养物质，避免损伤生长中的细胞，而且仅仅通过对储液池的液体更换就能够完成微流体操作和细胞培养，降低实验难度。
[0019]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0020]基于上述的一种简易微流控芯片进行间歇性细胞动态培养分析方法，包括如下进行的步骤:
[0021](1)将简易微流控芯片进行消毒，然后采用人层粘连蛋白溶液对微通道进行修饰；
[0022](2)将细胞悬液滴加至微通道的入口处，在毛细管作用力下细胞进入微通道内，然后在微通道一侧的储液池中注满细胞培养液，细胞培养液在重力作用下持续进入微通道并流向另一侧的储液池中，每隔一定时间将微通道两侧