一株防治植物根癌病的苍白杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农、林和园艺作物保护技术领域，特别涉及防治植物根癌病病的生防 细菌及其应用。 技术背景
[0002] 根癌病是由根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)引起的一种常见细菌性 病害。根癌土壤杆菌的寄主范围很广，能侵染93科、331属的643种植物（DeCleene，et al.，1981)。在欧洲、北美、南非及亚洲等一些国家普遍发生。而在我国较为严重的根癌病 发生区域为河北、山东、辽宁、河南、湖北、江苏等省区（马德饮和王慧敏，1995)。其中核果 类、浆果类、仁果类、坚果类果树以及一些林木和花卉受害较为严重，桃树幼苗受害后早衰， 植株矮化，甚至死亡；成龄树感染此病后会生长不良、树势变弱、果实小、产量低、树龄缩短 (尹玲莉，2009)，造成了重大的经济损失。目前对根癌病最有效的防治措施是轮作和生物防 治。但许多果园或苗圃无法实行常年轮作。提前使用生物菌剂是降低病原菌进入植物体内 并干扰其代谢的有效措施。本技术投入低、效率高，是一项农民认可的、可操作强的农产品 生产技术。
[0003] 因根癌土壤杆菌具有三种不同的生物型，其中III型为A.vitis，一般只侵染葡 萄；而I型和II型根癌土壤杆菌（A.tumefaciens)可侵染多种核果类和坚果类果树以及 其他林木、花卉和双子叶植物，危害更为广泛。前人研究报道对核果类果树根癌病有效的 生防菌对葡萄根癌病防效较差，而对葡萄根癌病有效的生防菌对核果类果树根癌病防效也 比较差。目前仅生防菌1^84(厶.抑(1;[(^&(^61')(1(61'1'，1972，]\1〇〇代6七311979)或1(1026 已 经在澳大利亚和美国登记注册（商品名为Nogall)。已报道的其他生防菌株还有：防治桉 树根癌病的根癌土壤杆菌无毒株D286 (Hendson，1983)、防治葡萄根癌病的生防菌E26 (A. vitis)(梁亚杰等 1990)、HLB_2(A.radiobacter) (Pu&Goodman，1993 ;游积峰等，1990)和 MI15(A.radiobacter)(谢学梅等，1984)、防治樱桃和梨根癌病的生防菌UHFBA-8和11 (A. radiobacter) (Gupta等，2010)。上述生防菌都属于土壤杆菌属细菌，其他属生防菌还有菌 根真菌（宋福强等，2005)、放线菌（梁静等，2008 ;季敬霖等，2011)、假单孢菌（张春明等， 1988,1991)、芽孢杆菌提取物（Hammami等，2009)等，但未商品化。因此针对在果树和其他 植物上发生普遍的由A.tumefaciens引起的根癌病，获得具有我国自主知识产权的生防菌 及其无细胞制剂对根癌病的防控具有重要的实际意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种防治植物根癌病的拮抗细菌，该拮抗细菌分离于山东 省泰安市桃树根际，对根癌病菌A.tumefaciens具有明显的措抗作用，并抑制根癌病菌 A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤。
[0005] 本发明的另一目的是提供本发明的可抑制根癌病发生的拮抗细菌的用途，其用途 是防治由A.tumefaciens引起的植物根癌病。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明提供的一株根癌病拮抗菌，其特征在于，该拮抗菌的分类命名为苍白杆菌 (Ochrobactrumoryzae)，于2014年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNo. 9634。
[0008] 该拮抗菌（2#)经形态、生理生化和16SrDNA序列同源性分析鉴定为苍白杆菌 Ochrobactrumoryzae，2#菌株在ρΗ7· 0-7. 5,温度28_35°C生长良好，可利用多种碳源生长。
[0009] 采用平板拮抗法测定该菌株的抗菌性能，发现2#菌株在YEB培养基上并不抑制根 癌土壤杆菌A.tumefaciens的生长，但菌体生长速度很快，菌落粘稠。分别以向日葵和番爺 作为感病植物，采用生物测定的方法，测定2#菌株对A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤 的抑制作用，结果表明：将lOkfuml1的2#菌株的菌悬液和A.tumefaciens菌悬液以10 : 1 的体积比混和，接种向日葵7天后，调查结果表明，2#菌株处理可显著抑制根癌瘤的形成，对 根癌病的防效为78. 1%。将100ml浓度为106cfuml1的2#菌株菌悬液提前浇灌番茄苗， 1天后烧灌同样体积同样浓度的A.tumefaciens菌悬液，可大大降低番爺上根癌瘤的形成， 防效为94. 9%。
[0010] 本发明的可防治植物根癌病的苍白杆菌的筛选：
[0011] 采集泰安桃园中桃树的根、茎和根际土，采用选择性培养基（NewKerr培养基）， 稀释涂布法对细菌进行分离。采用virD2A/virD2C引物5'-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3'， 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3'(Hass，.etal.，1995)和Tip6F/Tip6R引物： 5' -GGTCTAATGCGCAGAGGTGT-3, 5' -CGGCTCAAGGATTAGACAGG-3' (Yakabe，2012)，对所分离细 菌的vir区及T-DNA区进行测定，选择未扩增到224bp和243bp目的片段的菌株作为非致 病待测菌株。将A.tumefaciens菌悬液加入YEB培养基，然后点接待测菌株，28°C培养72h 后，发现一株不产生抑菌圈，但落颜色不同于前人报道的根癌土壤杆菌，而且生长迅速的菌 株。因该菌可在选择性培养基上生长，与根癌土壤杆菌的营养需求有相同之处，因此认为是 一株有潜力的拮抗菌，将该菌株定名为2#。以向日葵为感病植物，采用将在NB培养液中培 养的2#菌株的菌悬液和A.tunefaciens菌悬液（106cfuml^以体积比10 :1的比例混和后 接种的方法，测定2#菌株对A.tumefaciens在向日葵上形成根癌瘤的抑制作用，接种7天 后，调查发现2#菌株处理比单独接种A.tumefaciens的向日葵苗上根癌瘤明显减少，癌瘤 变小，对根癌病的防效可达到78. 1%。以番茄为感病植物，模拟田间种植模式，在中国农业 科学院植物保护研究所廊坊基地对2#菌株的防病效果进行了确认。在番茄移栽时，划伤番 茄幼苗茎基部，用浓度为l〇6cfuml1的2#菌株的菌悬液蘸根，每株番茄苗再浇灌100ml，1 天后浇灌同样体积同样浓度的A.tumefaciens菌悬液，2个月后调查，发现2#菌株菌悬液处 理可大大降低番茄茎基部根癌瘤的形成，癌瘤直径大幅度减小，防效为94. 9%。
[0012] 所述的细菌vir区的扩增体系（总体积：25· 0μL)为：DNA模板0· 6μL( < 1μg)、 上下游弓丨物（5pmol/yL)各 1.0yL、10X缓冲液 2.5yL、dNTPMixture(2.5mM each) 1· 5μL、Taq聚合酶（2. 5u/μL) 0· 5μL、超纯水 18. 0μL〇
[0013]PCR扩增条件：95°C预变性