酒石酸钠缓冲液（pH3.0)1.0mL，0.160mmol/L的Azure-B溶液 500yL，培养液上清液500yL，30°C下加入2.0mmol/L的H202溶液500μ/L启动反应，测反 应最初3.0min内λ=651nm处0D值减少速率，1个酶活力单位以每分钟每毫升的培养基滤 出液降低〇. 1个0D值表示。
[0047] 木质素过氧化物酶活力为46. 67±3.67U/mL。
[0048]2、锰过氧化物酶（ΜηΡ)活力测定 取 50mmol/L的乳酸钠缓冲液（pH4. 5) 3. 4mL，1. 6mmol/L的MnS04溶液 0· 1mL，0. 4mL的培养液上清，预热至37°C，加入1. 6mmol/L的H202溶液0. 1mL启动反应，测定反应 最初3. 0min内λ=240nm处吸光度值变化，1个酶活力单位用每分钟吸光度值增加0. 1的 酶量表示。
[0049] 锰过氧化物酶活力为52·98±4·28U/mL。
[0050] 3、漆酶活力测定 0.5mmol/LABTS的0.1mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.0)2mL，加入1mL酶液后启动 反应，测λ=420nm出吸光度变化，1个酶活力单位用每分钟1μmol的ABTS被转化所需的 酶量表示。
[0051] 漆酶活力为：0U/mL。
[0052] 实施例四：玉米秸杆木质素降解能力考察 称取长度为1~2cm左右的干玉米秸杆100kg，按1X10sCFU/kg玉米秸杆的用量接种 芽孢液。将浓度为1. 5X109CFU/mL芽孢液以适量水稀释均匀泼洒于秸杆上(秸杆含水量为 60%为宜)，充分混勾后将猜杆装于直径1. 2m大塑料袋中，堆高约1. 5m，封实，室温下（约 25°C)以堆积状态进行发酵培养，每间隔2d取样。设置同等施水量，且不接菌试验组为对 照。
[0053] 发酵过程中木质素降解情况：将发酵秸杆样品置于烘箱中，35~40°C烘干称重，粉 碎，测定秸杆木质素含量：将待测样品置于250mL碘量瓶中，加入2mol/L盐酸70mL，然 后放于已沸的高压锅中，l〇〇°C保温50min，过滤。用蒸馏水洗涤滤渣至中性，依次用95%乙 醇，无水乙醇和丙酮洗涤2次，残渣80°C烘干至恒重％。将残渣连同坩埚置于150mL烧杯 中，加入10mL冷的72%硫酸室温降解4h后加入90mL水，室温过夜，次日用蒸馏水洗残 渣至pH6.5,烘干至恒重W2。将残渣在550°C马弗炉中灰化，干燥器中恒重13，12-13即为 木质素量。
[0054] 木质素的含量与降解率的计算方法如下：木质素（％) =WVWiX100; 木质素降解率（％):对照组秸杆与发酵秸杆木质素含量的差值/对照组木质素含 量XIOOo
[0055] 发酵过程中木质素含量变化情况如图4所示，发酵24d后，玉米秸杆降解率可达 到 37. 5%〇
[0056] 实施例五：玉米秸杆木质素降解产物分析 将活化的菌株接种于NB培养基（50mL/250mL)中，30°C、180r/min培养18h。将种 子液在5 000r/min条件下，离心10min，倾去上清液，菌体用无菌水洗涤3次后，收集菌 体。在无菌条件下，将菌体置于适量无菌水中，充分振荡，制备菌悬液（10 1°CFU/mL)，备用。
[0057] 每250mL三角瓶中准确称取1mm猜杆粉10g，20mL无机盐培养基浸湿，混合均 匀，121°(：灭菌30 11^11。接种2 1^菌悬液到秸杆中，接种量为2.0\1090?1]/^秸杆，室温 下静止培养16d。设相同处理，不接菌为对照。发酵后的秸杆分别用氯仿和正丁醇(对照 组秸杆直接用正丁醇）进行回流提取，提取液用无水硫酸钠干燥、旋转蒸发仪浓缩至1mL。 向浓缩液中 100ML二氧六环、10KLP比啶和 50KLBSTFA[N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide]+TMCS(trimethylchlorosilane)，随后将混合液置于 60 °C水浴锅 内反应15min进彳丁甲基硅烷化(每间隔2min对样品进彳丁振汤摇勾)，将硅烷化后的样品作 为硅烷化衍生物进彳丁GC-MS检测。
[0058] 气-质色谱条件：HP-5毛细管柱（50mXO. 32mmXO. 25Mm);程序升温：初始温 度：50°C保持2min;以5°C/min速度升温至270°C;进样口温度：280°C;溶剂延迟4 min;离子源温度：250°C;离子源能量70eV;扫描质量数范围：14~800amu;进样量：0. 2 Λ;进样方式：分流，50 : 1。
[0059] 结果：气质色谱检测的离子流（TIC)结果如图5所示，玉米秸杆木质素降解产物的 GC/MS分析结果如表3所示。
[0060]实施例六：解淀粉芽抱杆菌a野ioJi识MN-13CGMCC No. 5591芽孢菌剂的制备 1、培养基 种子培养基：蛋白胨 1%，葡萄糖 1%，NaH2P04 · 2H20 0. 2%，MgS04 · 7H20 0. 05%，pH7. 2-7. 4。
[0061] 产芽孢发酵培养基：麦芽糖0· 5%、黄豆饼粉2%、KH2P04 · 2H20 0· 05%，MnS04 ·H20 0· 1%，蒸馏水 1000mL，pH7· 5。
[0062] 2、菌株种子培养 将斜面培养的供试菌株接种于装有种子培养基的三角瓶中。于200r/min，30°C，摇床 培养24h后使用，摇瓶容量为500mL，装量为100mL。
[0063] 3、菌株发酵培养 将培养好的液体菌种按10%的接种量接种于发酵培养基。于转速为200r/min，30°C条 件下，摇床培养48h。
[0064] 在此优化后的产芽孢发酵条件下，发酵液中芽孢生产率达到95 %以上，最终生物 量可达到 2· 65X109CFU/mL。
[0065] 4、芽孢菌剂的制备 取发酵液于5000r/min常温条件下离心浓缩10min。收集芽孢，向其中加入适量无菌 水，漩涡振荡器振荡均匀，做成芽孢浓度约为4. 0X101°CFU/mL菌悬液。按照1mL菌液/2g 麸皮的比例将制备好的菌悬液吸附于灭菌麦麸上，充分混匀后，置于45°C烘箱内烘干，即得 解淀粉芽孢杆菌的芽孢菌剂，芽孢浓度为2.OX101° CFU/g辅料，成品见图6。
[0066] 上述实施例是对本发明的具体说明而非限定，根据【背景技术】所述已知常识，结合 前述对解淀粉芽抱杆菌（^3<^7知61<3野76^_/识/6'/3(^6'/76 1)]\^-13 06]\〇^1^0.5591的产酶能力 和降解秸杆的试验，可以得出本菌株不仅可以在秸杆发酵中用于降解木质素以制取动物饲 料，其降解木质素的能力还可以被用于造纸、生物漂白和有机物料腐熟等需要降解木质素 的领域。
【主权项】
1. 解淀粉芽孢杆菌（即e/acieft?)MN-13,保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 5591。2. 解淀粉芽抱杆菌（你<^7知61<3野76^_/识/6'/^_/6'/?61)]\^-13 06]\0^1^〇.5591 在降解木 质素领域中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌株用于秸杆发酵中降解木质素以 制取动物饲料。4. 一种芽孢菌剂，其特征在于，所述芽孢菌剂含有保藏编号为CGMCCNo. 5591的解淀 粉芽抱杆菌（SaciUiAs·a野MN-13。
【专利摘要】本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌（<i>Bacillus？amyloliquefaciens</i>）MN-13及其应用，该菌株已于2011年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.5591。解淀粉芽孢杆菌（<i>Bacillus？amyloliquefaciens</i>）MN-13？CGMCC？No.？5591可产木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶，对木质素降解能力强，具有实用价值。CGMCC No.559120111214
【IPC分类】A23K10/30, C12N1/20, A23K10/12, C12R1/07, C12P1/04
【公开号】CN105420140
【申请号】CN201510589440
【发明人】李红亚, 李术娜, 朱宝成
【申请人】河北农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年9月17日